论文摘要
摘要抗菌肽Cecropin AD是人工合成的由CecropinA的N端1-11肽段和Cecropin D的C端12-37肽段组成的杂合肽。本试验的目的是利用组成型表达方法在毕赤酵母SMD1168菌株表达抗菌肽Cecropin AD,探讨优化发酵重组SMD1168菌株的条件,并研究抗菌肽Cecropin AD对断奶仔猪生长性能的影响。主要从以下几方面进行研究：1抗菌肽Cecropin AD在毕赤酵母中的组成型表达利用化学方法合成编码抗菌肽Cecropin AD的基因片段SH,并进行PCR扩增。基因片段SH与表达载体pGAPZa-A经Xho I和Not I双酶切后连接构建为重组表达质粒pGAPZa-ASH。经过鉴定并测序正确后将pGAPZa-ASH电转化至毕赤酵母SMD1168中,通过Zeocin抗性筛选阳性重组毕赤酵母工程菌。Tricine-SDS-PAGE分析表明在3.0 KD处有目的条带,并且表达产物抗菌肽Cecropin AD有生物活性。20μL浓缩10倍的表达上清液对E.coli DH5α的抑菌直径可达到17.5 mm,小于20μLAmp （100μg/mL）相应的抑菌直径（20.5 mm）。外源基因在酵母中的稳定性很高。重组酵母与其受体菌的生长曲线相近。试验结果表明,用组成型表达方法在毕赤酵母菌株成功表达了抗菌肽Cecropin AD并且其基因片段SH的插入对酵母菌的生长规律影响不显著。2抗菌肽Cecropin AD小规模发酵主要参数的优化按表达手册进行表达试验,从发酵液pH、溶氧和补料等方面优化重组毕赤酵母SMD1168的主要发酵参数。采用优化的发酵参数进行发酵,对上清液TCA沉淀纯化后以Tricine-SDS-PAGE鉴定。优化后的重组毕赤酵母SMD1168发酵主要参数：发酵液pH5.5,溶氧30%-40%,补料采用变速流加方式。发酵周期为60 h,上清液中Cecropin AD的表达量为225 mg/L, Cecropin AD占表达总蛋白量的26%。发酵液离心后的上清液占总发酵液体积的70%。3抗菌肽Cecropin AD对断奶仔猪生长性能的影响试验选取体重约10kg的杜×大×长三元杂交断奶仔猪300头,采用单因子完全随机区组设计,分为对照组、抗生素组、试验1组、试验2组、试验3组,每个处理6个重复,每个重复10头猪,研究毕赤酵母组成型表达的抗菌肽对断奶仔猪生长性能的影响。对照组饲喂基础日粮,抗生素组在基础日粮中添加10%的硫酸抗敌素300 mg/kg和10%的杆菌肽锌1500 mg/kg,试验1组、试验2组、试验3组分别在基础日粮中添加抗菌肽Cecropin AD 10 mg/kg、20 mg/kg、30 mg/kg。试验结果表明,与对照组相比,日粮中添加抗生素或抗菌肽有提高断奶仔猪日增重和饲料转化效率的趋势,但没达到显著差异（P>0.05）；试验各组仔猪的腹泻率均显著低于对照组（P<0.05）,表明抗菌肽CecropinAD可以达到与抗生素类似的防腹泻效果。综合考虑仔猪的生长性能和腹泻指数,以添力口10 mg/kg Cecropin AD效果最佳。