论文摘要
癫痫是由各种原因引起的脑功能障碍综合征,即脑细胞群异常放电所致的发作性、暂时性的脑功能紊乱,具有反复性、阵发性、发作性等特点。我国每年新增癫痫病人30余万,估计已有癫痫病人455万～630万人,至少有约80万～100万癫痫病人癫痫发作药物难以控制,长期反复发作成为药物难治性癫痫,成为临床治疗中的难题。随着立体定向放射神经外科的兴起,伽玛刀成为不开颅治疗颅内病变的重要手段。尤其是可进行术前无创性致痫灶定位的脑磁图（magnetoencephalogram, MEG）的出现,更推动了伽玛刀在药物难治性癫痫治疗中的应用。立体定向放射外科的临床资料提示,伽玛刀可以在不损伤靶区组织正常功能的情况下减少或治愈癫痫发作。N-甲基-D-天氡氨酸（N-methyl-D-aspartate, NMDA）受体是离子型谷氨酸受体的一种亚型,与特性性配体结合后离子通道开放,具有高的Ca2+渗透性,Ca2+的内流可触发不同形式的突触可塑性（突触可塑性指的是突触的形态、大小、数目及递质受体等改变引起突触传递功效改变）分子过程,因而在中枢神经系统的突触传递和突触可塑性调节中起着重要的作用。癫痫的病因和病理机制非常复杂,但NMDA受体与癫痫的关系已经较为肯定。有研究表明,NMDA受体在癫痫的发生发展及持续过程中均发挥重要作用。在癫痫的病因学研究中,目前发现少数几种原发性癫痫是由离子通道的基因突变所致,提示离子通道本身结构和功能的变化与癫痫发病密切相关。其中,电压门控钠离子通道结构和功能异常在癫痫的发生发展中占有重要地位。第一部分伽玛刀对大鼠皮层神经元NMDA受体表达的影响目的:观察伽玛刀照射对大鼠额叶NMDAR亚基蛋白、mRNA表达的影响。方法:通过立体定向技术,对18只雄性健康Wistar大鼠（随机分为2个剂量组）进行伽玛刀照射,中心剂量分别为30 Gy和60 Gy。于照射后24 h、30 d、60 d取材,通过免疫组织化学、原位杂交等方法检测靶区脑组织NR1、NR2A、NR2B蛋白和mRNA的表达。结果:中心剂量30 Gy伽玛射线照射后1 d和30 d,实验组和对照组相比,靶区皮层神经元NR1、NR2A和NR2B蛋白和mRNA表达均未发生显著性改变,照射后60 d,靶区皮层神经元NR1和NR2A蛋白和mRNA表达均显著增强,但未检测到NR2B蛋白和mRNA表达变化。与对照组相比,60 Gy组大鼠靶区皮层神经元NR1、NR2A和NR2B蛋白和mRNA在照射后30 d开始表达增强,一直持续到照射后60 d。但皮层神经元NR2B蛋白和mRNA表达在观察期内未发生显著变化。在观察期内,靶区尾状核区域神经元NR1、NR2A和NR2B蛋白和mRNA表达均未发生显著性改变。结论:伽玛刀引起靶区皮层神经元内NMDA受体亚基蛋白和mRNA表达升高,可能是伽玛刀治疗难治性癫痫等神经系统疾病的机制之一。第二部分伽玛刀对大鼠皮层神经元胞浆内游离钙离子水平的影响目的:观察伽玛刀对正常大鼠皮层神经元胞浆内游离钙离子水平的影响。方法:24只雄性Wistar大鼠随机分为假照射组和两个照射组,两个照射组以大鼠左侧额叶为靶区进行伽玛刀照射,中心剂量分别为30 Gy（9只动物）和60 Gy（9只动物）,于照射后24 h、30 d、60 d处死动物,急性分离皮层神经元并负载游离钙离子荧光染料fluo-3,激光共聚焦显微镜观察皮层神经元胞浆内游离钙离子浓度。结果:伽玛刀照射后24 h,两照射组大鼠靶区皮层神经元胞浆内游离钙离子荧光强度与假照射组相比无显著性差异。伽玛刀照射后30 d,30 Gy组大鼠靶区皮层神经元胞浆内游离钙离子荧光强度与对照组相比无显著变化,60 Gy组靶区皮层神经元胞浆内游离钙离子荧光强度显著高于假照射组,P<0.05。伽玛刀照射后60 d,两照射组大鼠靶区皮层神经元胞浆内游离钙离子荧光强度均显著高于假照射组,P<0.05。结论:伽玛刀可能通过上调NMDA受体亚基表达水平引起靶区神经元胞浆内游离钙离子水平在较长时期内保持相对超载状态。第三部分伽玛刀照射对体外培养大鼠皮层神经元NMDA诱导电流的影响目的:观察伽玛刀对体外培养大鼠皮层神经元NMDA诱导电流的影响。方法:将原代培养的新生大鼠皮层神经元随机分为4个实验组和4个相应的对照组,通过立体定向技术和18 mm准直器对实验组原代培养大鼠皮层神经元实施伽玛刀照射,中心剂量30Gy。4个实验组和相应对照组神经元分别于照射后1、3、7、10 d分别通过免疫蛋白印迹和膜片钳技术检测NMDA受体亚基蛋白表达情况和在全细胞模式下记录神经元静息电位和NMDA诱导电流,每组记录神经元6-8个。结果:免疫蛋白印迹检测结果提示,伽玛刀照射后3、7、10 d,原代培养神经元NMDA受体亚基NR1和NR2A表达显著增强,与对照组相比,P<0.05,差异有统计学意义。伽玛刀照射后1、3、7、10 d,NMDA受体亚基NR2B表达与对照组相比无显著性变化。电生理学结果显示,伽玛刀照射后3、7、10 d,通过膜片钳记录神经元NMDA诱导电流,照射组皮层神经元的INMDA峰值密度（pA/pf）均显著高于对照组皮层神经元的INMDA峰值,差异有统计学意义,P<0.05。结论:伽玛刀照射可以增强NMDA诱导的皮层神经元内向电流。第四部分伽玛刀照射对体外培养大鼠皮层神经电压依赖性钠电流的影响目的:观察伽玛刀对体外培养大鼠皮层神经元电压依赖性钠电流的影响。方法:将原代培养的神经元随机分为4个实验组和4个相应的对照组,通过立体定向技术和18 mm准直器对实验组原代培养大鼠皮层神经元实施伽玛刀照射,中心剂量30 Gy。4个实验组和相应对照组神经元分别于照射后1、3、7、10 d通过膜片钳技术在全细胞模式下记录电压依赖性钠电流,每组记录神经元6-8个。结果:伽玛刀照射后1、3、7、10 d通过膜片钳记录神经元电压依赖性钠电流,结果显示,实验组皮层神经元电压依赖性钠电流峰值密度（pA/pF）分别为89.94±4.65、84.13±4.56、80.27±5.18和80.80±5.41,与对照组（照射后1、3、7、10 d分别为100.93±4.63、97.89±4.77、100.76±5.90和102.84±4.08）相比均显著减小（P<0.05）,且随观察时间延长电流峰值密度减小程度增加,呈一定时间依赖性,另外,实验组神经元电压依赖性钠电流的I-V曲线明显上移,下降支明显右移。结论:伽玛刀照射通过抑制电压依赖性钠离子通道的功能引起大鼠皮层神经元兴奋性下降,可能是伽玛刀照射抑制癫痫发作的分子机制之一。
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