中国新疆地区传统发酵酸马奶的化学组成及乳酸菌生物多样性研究

论文摘要

本课题对新疆不同地区传统发酵酸马奶的化学及微生物组成进行了分析，同时对酸马奶中的乳酸茵的生物多样性及DNA多态性进行了研究。为全面系统地了解新疆地区酸马奶的组成特点提供了基础数据，也为进一步开发和利用传统发酵乳制品中的乳酸菌资源奠定了基础，同时初步建立了一套在分子水平上对乳杆菌进行分类的AFLP试验体系。对新疆地区28份传统发酵酸马奶的化学及微生物组成研究结果表明：酸马奶样品中脂肪、蛋白质、乳糖、灰分、钙和磷的平均含量分别为（1.87±0.33）g／100mL、（2.07±0.29）g／100mL、（2.6±0.63）g／100mL、（0.28±0.05）g／100mL、（72.25±13.46）mg／100mL、（52.23±11.35）mg／100mL。28份酸马奶的pH值平均为3.8±0.27，酸度平均为（106.57±43.21）°T，乳酸含量平均为（9.10±3.56）g／L，乙酸含量平均为（1.18±0.50）g／L，柠檬酸含量平均为（0.06±0.06）g／L，乙醇含量平均为（14.52±3.79）g／L。大多数酸马奶样品中的乳酸菌数在1．07×107cfu／mL～9.70x107cfu／mL之间，酵母菌数在105cfu／mL～106cfu／mL之间，总体而言，酸马奶中乳酸菌数要较酵母菌数高1～2个对数级。从28份酸马奶样品中共分离到152株乳杆菌，采用传统分类鉴定方法对其进行鉴定，结果表明该地区酸马奶中的乳杆菌主要有Lactobacillus（L．）helveticus（占总分离株的51.3％），L．acidophilus（18.4％）和L．casei subsp．pseudoplantarum（8.6％）。此外，L．gasseri、L．casei subsp．casei、L．sanfrancisco、L．coryniformis subsp．coryniformis、L．curvatus、L．brevis、L．plantrum、L．homohiochii、L．fermentum、L．dellbrueckii subsp．bulgaricus、L．ruminis、L．crispatus、L．farciminis及L．hilgardii等乳杆菌在酸马奶中也有出现，但其数量较少（1～4株），还有8株乳杆菌按目前的鉴定方法无法准确判断其归属。新疆不同地区酸马奶中的乳杆菌的种类和数量有所不同，呈现出多样性，但L．helveticus和L．acidophilus存在于所有的酸马奶样品中，L．helveticus为新疆地区酸马奶中的优势乳杆菌。耐酸性研究结果表明，大多数乳杆菌分离株（69.1％）可以在pH3.5的培养基上生长。利用16S～23S rDNA短间隔区（Short ISR）序列分析的方法，对8株未能鉴定到种的乳杆菌进行了鉴定。结果表明，XF5-2为L．casei subsp．casei，B10-2和XB2-3为L．helveticus，E91和E112为L．kefir，C56、D73和E96暂定为L．ferintoshensis。16S～23S rDNA短间隔区序列分析可以识别L．rhamnosus和L．casei，而对于L．ferintoshensis、L．kefir、L．buchneri和L．hilgardii的区分效果不明显，但是仍有助于将未知乳杆菌归入这一群。采用AFLP标记对分离自新疆地区酸马奶中的部分乳杆菌DNA多态性研究结果表明，在73％的相似性水平上67株乳杆菌被分为18个AFLP群，表现出较高的DNA多态性，并且可以将L．casei、L．acidophilus和L．helveticus区分开，对L．helveticus的聚类结果与传统分类鉴定结果基本一致。DNA多态性显示L．sanfrancisco、L．curvatus、L．coryniformis subsp．coryniformis、L．brevis、L．fermentum、L．ruminis、L．crispatus及L．hilgardii之间具有较高的相似性，并且在73％的相似性水平上与8株L．casei聚为一群。种内分型结果表明，在73％的相似性水平上可以将L．acidophilus、L．casei和L．helveticus分别分为12个、8个和9个AFLP基因型，菌株的AFLP基因型与其来源之间没有必然的联系，存在有交叉。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 文献综述
• 1.1.1 酸马奶的历史
• 1.1.1.1 酸马奶的起源
• 1.1.1.2 酸马奶的传统制作
• 1.1.1.3 传统医学对马乳及酸马奶的认识和利用
• 1.1.2 酸马奶研究进展
• 1.1.2.1 酸马奶的生产原料—马乳的组成及生理功能研究
• 1.1.2.2 酸马奶的理化组成及微生物学研究
• 1.1.2.3 酸马奶的纯菌种发酵及模拟酸马奶研究
• 1.1.3 乳酸菌分类研究进展
• 1.1.3.1 经典分类时期
• 1.1.3.2 化学分类时期
• 1.1.3.3 数值分类时期
• 1.1.3.4 分子分类时期
• 1.1.4 新疆的酸马奶资源
• 1.2 立题的意义与研究内容
• 1.2.1 立题的目的及意义
• 1.2.2 本课题的主要研究内容
• 2 新疆地区传统发酵酸马奶的化学与微生物组成分析
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 试验材料
• 2.1.1.1 样品来源
• 2.1.1.2 培养基及试剂
• 2.1.1.3 仪器设备
• 2.1.2 试验方法
• 2.1.2.1 酸马奶样品采集
• 2.1.2.2 酸马奶化学组成分析
• 2.1.2.3 酸马奶中乳酸菌和酵母菌的计数
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 酸马奶的温度与PH值
• 2.2.2 酸马奶的化学组成
• 2.2.3 酸马奶中乳酸菌和酵母菌计数
• 2.3 讨论
• 2.4 小结
• 3 新疆地区传统发酵酸马奶中乳酸菌生物多样性研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 试验材料
• 3.1.1.1 样品来源
• 3.1.1.2 参考菌株
• 3.1.1.3 培养基与试剂
• 3.1.1.4 仪器设备
• 3.1.2 试验方法
• 3.1.2.1 酸马奶中乳酸菌的分离纯化及保存
• 3.1.2.2 酸马奶中乳酸菌分离株的鉴定
• 3.1.2.3 酸马奶中耐酸性乳杆菌的初步筛选
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 酸马奶中乳酸菌的分离
• 3.2.2 酸马奶中乳酸菌分离株的菌落形态及菌体细胞形态
• 3.2.3 酸马奶中乳酸菌属的鉴定
• 3.2.4 酸马奶中乳杆菌属内种的鉴定
• 3.2.5 酸马奶中乳杆菌耐酸菌株的初步筛选
• 3.3 讨论
• 3.4 小结
• 4 新疆地区酸马奶中未知乳杆菌的16S—23S rDNA间隔区序列测定
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 试验材料
• 4.1.1.1 供试菌株
• 4.1.1.2 PCR扩增引物
• 4.1.1.3 主要试剂及试剂盒
• 4.1.1.4 仪器设备
• 4.1.2 试验方法
• 4.1.2.1 乳杆菌菌株培养及基因组DNA提取
• 4.1.2.2 乳杆菌16S～23SrDNA短间隔区克隆
• 4.1.2.3 乳杆菌16S～23SrDNA短间隔区测序
• 4.1.2.4 乳杆菌16S～23SrDNA短间隔区序列比对与系统发育树建立
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 乳杆菌DNA提取
• 4.2.2 乳杆菌16S～23SrDNA间隔区扩增
• 4.2.3 乳杆菌16S～23SrDNA短间隔区胶回收
• 4.2.4 阳性克隆的筛选及鉴定
• 4.2.5 乳杆菌16S～23SrDNA短间隔区序列分析
• 4.2.6 序列比对与系统发育树分析
• 4.3 讨论
• 4.4 小结
• 5 新疆地区传统发酵酸马奶中部分乳杆菌DNA多态性研究
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 试验材料
• 5.1.1.1 菌株来源
• 5.1.1.2 参考菌株
• 5.1.1.3 人工接头和AFLP引物
• 5.1.1.4 酶及其它试剂
• 5.1.1.5 仪器设备
• 5.1.2 试验方法
• 5.1.2.1 乳杆菌的活化及菌体收集
• 5.1.2.2 乳杆菌基因组DNA提取
• 5.1.2.3 AFLP模板DNA制备
• 5.1.2.5 AFLP-PCR选择性扩增
• 5.1.2.6 选择性扩增产物的电泳及染色
• 5.1.2.7 聚类分析
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 乳杆菌基因组DNA提取
• 5.2.3 接头连接以及预扩增
• 5.2.4 选择性扩增引物的筛选
• 5.2.5 AFLP标记的重复性
• 5.2.6 乳杆菌AFLP标记结果及种间分析
• 5.2.7 乳杆菌AFLP标记种内分型
• 5.2.7.1 L.casei的种内分型
• 5.2.7.2 L.helveticus的种内分型
• 5.2.7.3 L.acidophilus的种内分型
• 5.3 讨论
• 5.4 小结
• 6 总体讨论与结论
• 6.1 总体讨论
• 6.2 结论
• 致谢
• 参考文献
• 作者简介