禽流感病毒非结构蛋白与宿主相关蛋白相互作用及感染鸡组织病理学研究

论文摘要

禽流感（Avian Influenza,AI）是由禽流感病毒（Avian Influenza Virus,AIV）引起的一种禽类感染和/或疾病综合征,被世界动物卫生组织（OIE）和我国定为A类传染病。自1878年首次在意大利暴发以来,已在世界各地广泛流行。近年来,AI出现了新特点,尤其是高致病性禽流感病毒（HPAIV）通过抗原漂移和抗原转变,已获得了感染人并造成死亡的能力,这赋予了HPAIV更重要的公共卫生学意义。目前,AIV致病机制还不甚清楚,可能是多基因共同作用的结果。其中,非结构蛋白（Non-structural protein,NS1）只存在于病毒感染的细胞内,是在细胞水平上的调节AIV致病性的关键因子。NS1蛋白主要是通过其RNA结合区和效应区与宿主内的许多蛋白相互作用来实现的,但这些研究大多数是采用人流感及其适应性细胞来研究的,而利用AIV及其天然宿主的研究还未见报道。因此,深入开展HPAIV的NS1蛋白与其天然宿主蛋白之间的相互作用研究,可进一步揭示NS1蛋白的功能及其调节HPAIV致病力的机制。因此,本研究利用HPAIV及SPF鸡为实验材料,运用组织病理学及蛋白质相互作用技术,研究了SPF鸡感染AIV的细胞凋亡、NS1蛋白的分布及NSl蛋白的相互作用蛋白,取得了如下成果:1 H9N2亚型AIV NSl基因的遗传进化分析利用RT-PCR方法,扩增了1998-2005年间分离的9株H9N2亚型AIV的NS1基因,序列分析表明,9株AIV NS1基因完整的阅读框均为654bp,编码217个氨基酸,其核苷酸及其推导氨基酸同源性分别为95.4%-99.8%和93.6%-100%;9株病毒的NS1蛋白的C-端均缺失了13个aa,已成为中国大陆分离株（H9N2亚型）的一个分子标记。进化分析表明,所有分离株都属于基因A群,形成了一个独立分支,且均起源于中国最早的分离株（Ck/BJ/1/94株）,说明H9N2亚型AIV的NS1基因随着流行时间出现了分化。另外,除Ck/HN/A3/98株外其余8株属于Ck/SH/F/98-like,这说明了Ck/SH/F/98-like株的H9N2亚型AIV在中国大陆鸡群中广泛存在。2 SPF鸡感染高致病性禽流感病毒（H5N1亚型）细胞凋亡的研究用末端转移酶介导的缺口末端标记法（TdT-mediated X-dUTP nick end labling,TUNEL）研究了SPF鸡人工感染HPAIV（H5N1亚型）的细胞凋亡,结果表明,HPAIV（H5N1亚型）能诱导各脏器不同程度的细胞凋亡,以胸腺、法氏囊、胰脏、肾脏的细胞凋亡最严重,凋亡细胞主要为血管内皮细胞、腺上皮细胞、软骨细胞及部分淋巴细胞。本研究表明,HPAIV可诱导本动物发生快速的细胞凋亡。3 HPAIV（H5N1亚型）NS1蛋白在感染鸡组织中分布研究利用NS1蛋白单克隆抗体,建立了检测NS1蛋白的免疫组化法（SABC法）,并研究了HPAIV感染30-31h后NS1蛋白在鸡各脏器中的分布,结果表明,NS1蛋白主要分布于心脏、胰脏、肾脏及小脑颗粒层;阳性细胞主要为各组织器官的小或微血管内皮细胞、心肌细胞、肾小管上皮细胞、腺上皮细胞、部分淋巴细胞及坏死灶周围的细胞,说明了心肌、胰腺、肾脏、小脑及血管内皮细胞可能是HPAIV的主要靶器官。结合细胞凋亡的研究结果,可推测,心血管系统在HPAIV的复制和扩散中起重要作用。同时也证明了NS1蛋白与细胞凋亡有相关性。4利用酵母双杂交系统筛选NS1蛋白相互作用的宿主蛋白本研究利用SMART技术首次构建了HPAIV感染鸡脾脏cDNA文库,然后利用酵母双杂交系统从该cDNA文库中初步筛选到了4个能与NS1蛋白相互作用的蛋白,序列测定和Blast分析表明,4个基因分别为鸡源ISG12-2、IRF2、PPM1F及AIV的M蛋白,其中ISG12-2和IRF2基因含完整阅读框。推测,NS1蛋白可能是通过调节干扰素的产生、自身磷酸化及调节病毒复制等方式来发挥其调节AIV致病力的功能。这些蛋白的获得,进一步解释了NS1蛋白在调节HPAIV致病性方面的作用,同时也为HPAIV感染人的机制提供了有意义的参考。5利用细菌双杂交系统和GST融合蛋白沉降技术验证NS1蛋白与ISG12-2和IRF2蛋白的相互作用本研究利用细菌双杂交系统和GST融合蛋白沉降技术进一步验证NS1蛋白分别与ISG12-2及IRF2蛋白的相互作用,结果表明,在体内和体外,NS1蛋白与ISG12-2及IRF2蛋白间存在相互作用。NS1蛋白与ISG12-2和IRF2的相互作用,可能抑制某些IFN表达相关通路,拮抗IFN的表达,降低机体的抗病毒状态,利于AIV的复制和扩散。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表（Abbreviation）
• 第1章 文献综述
• 1 禽流感的流行与危害
• 1.1 高致病性禽流感
• 1.2 低致病性禽流感
• 1.3 当前我国禽流感流行的新动态
• 1.3.1 低致病性禽流感（H9N2亚型）仍是当前流行的主要亚型
• 1.3.2 温和性禽流感和隐性感染更为常见
• 1.3.3 高致病力禽流感对水禽的毒力增强
• 1.3.4 AIV对哺乳动物的致病力在增强
• 2 禽流感病毒的特征及其致病的分子机制
• 2.1 禽流感病毒的特征
• 2.2 禽流感病毒的基因组及其编码蛋白
• 2.3 禽流感病毒致病性相关基因及其分子机制
• 2.3.1 血凝素（Hemagglutinin,HA）
• 2.3.2 神经氨酸酶（Neuraminidase,NA）
• 2.3.3 非结构蛋白（Non-structural Protein,NS）
• 2.3.4 基质蛋白（Matrix Proteins,M）
• 2.3.5 核蛋白（Nucleoprotein,NP）及聚合酶（Polymerase）
• 2.4 禽流感病毒宿主特异的分子基础
• 2.4.1 宿主受体
• 2.4.2 HA蛋白
• 2.4.3 宿主受体对HA受体特异性的选择
• 2.4.4 其他分子机制
• 3 NS1蛋白的研究进展
• 3.1 NS1蛋白的分群及进化分析
• 3.2 NS1蛋白的结构
• 3.3 NS1蛋白与A型流感病毒的致病性
• 3.3.1 抑制宿主蛋白的合成
• 3.3.2 下调细胞凋亡
• 3.3.3 拮抗干扰素的产生
• 3.3.4 NS1蛋白与宿主蛋白相互作用
• 3.4 NS1蛋白的应用
• 3.4.1 NS1蛋白在禽流感鉴别诊断上的应用
• 3.4.2 可作为携带外源基因的载体
• 3.4.3 抗肿瘤
• 4 机体的抗病毒机制
• 4.1 抗病毒的信号传导途径
• 4.1.1 TLR信号传导途径
• 4.1.2 RIG-I信号转导途径
• 4.2 抗病毒相关蛋白
• 4.2.1 干扰素
• 4.2.2 IFN诱导的抗病毒蛋白
• 4.2.3 MAVS
• 4.2.4 APOBEC3G
• 5 蛋白质相互作用的研究进展
• 5.1 酵母双杂交系统（Y2H）
• 5.2 串联亲和纯化（TAP）
• 5.3 蛋白质芯片技术（Protein chip）
• 5.4 免疫共沉淀（Co-IP）
• 5.5 荧光共振能量转移（FRET）
• 5.6 表面等离子共振（SPR）
• 5.7 基于生物信息学的蛋白质互作的研究方法
• 第2章 NS1基因的遗传进化分析
• 1 研究目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 主要试剂与仪器
• 2.2 毒株、菌株和质粒
• 2.3 引物设计与合成
• 2.4 病毒的增殖与浓缩
• 2.5 RNA提取
• 2.6 RT-PCR扩增NS1基因
• 2.7 PCR产物的纯化及克隆
• 2.8 NS1基因序列测定及进化分析
• 3 结果与分析
• 3.1 RT-PCR扩增
• 3.2 重组质粒鉴定
• 3.3 NS1基因核苷酸及其推导氨基酸同源性分析
• 3.4 分离株NS1蛋白变异分析
• 3.5 分离株的NS1基因进化分析
• 4 讨论
• 4.1 NS1基因核苷酸和氨基酸的同源性分析
• 4.2 NS1蛋白的突变位点分析
• 4.3 NS1蛋白C-端氨基酸缺失的生物学意义
• 5 小结
• 第3章 SPF鸡感染高致病性禽流感病毒细胞凋亡的研究
• 1 研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 主要试剂与仪器
• 2.2 病毒
• 2.3 试验动物
• 2.4 SPF鸡的饲养与病毒感染
• 2.5 组织样品的采集与固定
• 2.6 石蜡组织切片的制备
• 2.6.1 载玻片和盖玻片的处理
• 2.6.2 组织包埋
• 2.6.3 组织切片的制备
• 2.7 TUNEL法检测细胞凋亡
• 2.8 结果判定
• 2.9 凋亡指数和统计学分析
• 3 结果与分析
• 3.1 SPF鸡感染HPAIV后的临床症状及剖检变化
• 3.2 HPAIV诱导的细胞凋亡
• 3.2.1 AIV诱导鸡免疫器官的细胞凋亡
• 3.2.2 AIV诱导鸡呼吸器官的细胞凋亡
• 3.2.3 AIV诱导鸡消化器官的细胞凋亡
• 3.2.4 AIV诱导肾脏和心脏的细胞凋亡
• 4 讨论
• 4.1 细胞凋亡的研究意义
• 4.2 细胞凋亡的检测方法
• 4.3 AIV感染与细胞凋亡相关性分析
• 5 小结
• 第4章 禽流感病毒NS1蛋白在感染鸡组织中分布研究
• 1 研究目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 主要试剂与仪器
• 2.2 病毒及试验动物
• 2.3 SPF鸡的饲养与病毒感染
• 2.4 组织样品的采集与固定
• 2.5 石蜡组织切片的制备
• 2.6 NS1蛋白的免疫组化检测
• 2.7 结果判定
• 3 结果与分析
• 3.1 SABC法最佳反应条件的确定
• 3.2 NS1蛋白在各脏器中的分布
• 3.2.1 NS1蛋白在免疫器官中的分布
• 3.2.2 NS1蛋白在呼吸器官中的分布
• 3.2.3 NS1蛋白在消化器官中的分布
• 3.2.4 NS1蛋白在肾脏中的分布
• 3.2.5 NS1蛋白在心脏和脑中的分布
• 4 讨论
• 4.1 NS1蛋白与AIV感染
• 4.2 NS1蛋白在免疫器官的分布
• 4.3 NS1蛋白在非免疫器官的分布
• 4.4 NS1蛋白的分布与细胞凋亡相关性分析
• 5 小结
• 第5章 利用酵母双杂交系统筛选NS1蛋白互作的宿主蛋白
• 1 研究目的与意义
• 2 材料与方法
• 2.1 主要仪器
• 2.2 试剂与质粒
• 2.2.1 NS1基因克隆及cDNA文库构建相关试剂
• 2.2.2 酵母双杂交系统相关菌株、质粒、试剂及配制方法
• 2.3 NS1基因的克隆与表达
• 2.3.1 NS1基因的扩增
• 2.3.3 PCR产物的TA克隆及序列分析
• 2.3.4 NS1基因的表达与活性分析
• 2.4 重组诱饵质粒pGBKT7/NS1的构建
• 2.4.1 重组诱饵质粒pGBKT7/NS1的构建的基本策略
• 2.4.2 诱饵质粒和插入片段的连接和转化
• 2.4.3 重组诱饵质粒pGBKT7/NS1的鉴定
• 2.5 酵母双杂交重组诱饵质粒的转化及自激活检测
• 2.5.1 酵母菌株AH109营养表型的验证
• 2.5.2 酵母菌株AH109感受态细胞的小量制备
• 2.5.3 诱饵质粒pGBKT7/NS1转化AH109感受态细胞
• 2.5.4 pGBKT7/NS1转化AH109后的自激活检测
• 2.5.5 转化的pGBKT7/NS1对AH109毒性的检测
• 2.6 AIV感染鸡脾脏cDNA片段的制备
• 2.6.1 组织总RNA的提取
• 2.6.2 mRNA的分离
• 2.6.3 双链cDNA的合成
• 2.6.3.1 cDNA第一链的合成
• 2.6.3.2 LD-PCR扩增双链cDNA
• 2.6.3.3 ds cDNA的纯化
• 2.7 酵母双杂交文库的构建及筛选
• 2.7.1 重组诱饵质粒pGBKT7/NS1酵母感受态细胞的制备
• 2.7.2 脾ds cDNA、pGADT-Rec共转化含pGBKT7/NS1的AH109感受态细胞
• 2.8 酵母双杂交阳性克隆子的鉴定
• 2.8.1 β-半乳糖苷酶印膜法检测lacZ报告基因的表达
• 2.8.2 PCR扩增脾ds cDNA片段、测序、比对分析
• 3 结果与分析
• 3.1 NS1基因的扩增、克隆与表达
• 3.2 NS1基因的序列分析
• 3.3 NS1蛋白的表达及western-blotting分析
• 3.4 重组诱饵质粒pGBKT7/NS1的构建与鉴定
• 3.5 酵母双杂交重组诱饵质粒的转化及自激活检测
• 3.5.1 酵母菌株AH109营养表型的验证
• 3.5.2 pGBKT7/NS1转化AH109后的自激活检测
• 3.5.3 pGBKT7/NS1对AH109毒性的检测
• 3.6 脾总RNA的提取
• 3.7 mRNA的分离
• 3.8 LD-PCR制备ds cDNA片段
• 3.9 NS1蛋白互作蛋白的筛选与鉴定
• 3.9.1 转化效率的测定
• 3.9.2 阳性克隆的筛选
• 3.9.3 β-半乳糖苷酶印膜法检测阳性克隆子
• 3.9.4 阳性克隆子内ds cDNA片段的PCR扩增
• 3.9.5 阳性克隆片段的测序与分析
• 4 讨论
• 4.1 NS1蛋白与宿主蛋白间的相互作用
• 4.2 酵母双杂交系统
• 4.3 ISG12蛋白
• 4.4 IRF家族
• 4.5 AIV的M蛋白
• 4.6 PPM1F蛋白
• 5 小结
• 第6章 利用细菌双杂交系统和GST融合蛋白沉降技术验证NS1蛋白与ISG12-2和IRF2蛋白的相互作用
• 1 研究目的与意义
• 2 材料与方法
• 2.1 主要仪器
• 2.2 菌株及质粒
• 2.3 试剂及配制方法
• 2.4 细菌双杂交重组捕获质粒pTRG/ISG12和pTRG/IRF的构建与鉴定
• 2.4.1 ISG12-2和IRF2基因的克隆
• 2.4.2 重组捕获质粒pTRG/ISG12和pTRG/IRF的构建与鉴定
• 2.4.3 重组捕获质粒pTRG/ISG12和pTRG/IRF的诱导表达
• 2.5 重组诱饵质粒和捕获质粒的共转化及鉴定
• 2.6 细菌双杂交试验验证NS1蛋白与ISG12-2和IRF2蛋白的互作
• 2.7 GST融合蛋白沉降试验验证NS1蛋白与ISG12-2、IRF2的相互作用
• 2.7.1 NS1蛋白、ISG12-2和IRF2蛋白的原核表达与纯化
• 2.7.2 GST融合蛋白沉降技术验证NS1蛋白与靶蛋白间的相互作用
• 3 结果与分析
• 3.1 ISG12-2和IRF2基因的PCR扩增
• 3.2 重组捕获质粒pTRG/ISG12和pTRG/IRF的构建与鉴定
• 3.3 重组捕获质粒pTRG/ISG12和pTRG/IRF的诱导表达
• 3.4 重组诱饵质粒和捕获质粒的共转化及鉴定
• 3.5 细菌双杂交验证NS1蛋白与ISG12-2、IRF2的相互作用
• 3.6 ISGl2-2和IRF2的原核表达及纯化
• 3.7 GST融合蛋白沉降试验验证NS1蛋白与ISG12-2、IRF2的互作
• 4 讨论
• 4.1 NS1蛋白的功能及其互作蛋白
• 4.2 互作蛋白的进一步验证
• 5 小结
• 参考文献
• 研究生期间发表的主要论文
• 致谢