论文摘要
前言Ghrelin是近年来发现的一个由28个氨基酸组成的脑肠肽,主要来源于胃,是生长激素促泌素受体（Growth hormone secretagogue receptor,GHS-R）的内源性配体,在循环水平中有二种存在形式,一种是酰基化形式,其位于氨基端第3位丝氨酸有脂肪酸链(C7H15CO)修饰,该酰基化被认为是ghrelin发挥功能的主要活性结构,另一种是非酰基化形式,目前有研究表明其也具有功能。研究证明ghrelin及其受体存在于全身多处,决定其功能的多样性,由于ghrelin及其受体mRNA在心血管组织（心脏、主动脉、外周动静脉）的表达表明其可能具有心血管功能,研究者们对于ghrelin在心血管的功能进行了广泛的研究,发现ghrelin在心血管的能量代谢效应、内分泌效应、血管效应及细胞效应等方面均发挥了广泛的作用。随着人们生活条件的改善和生活方式的变化,糖尿病患病率逐年递增,已经成为一种世界性流行性疾病,并且随着糖尿病急性并发症发生率及病死率日益减少,长期慢性血管并发症日益突出,已经成为糖尿病治疗的核心问题,其中大血管并发症更是导致糖尿病患者致死致残的主要原因。糖尿病控制和并发症研究（Diabetes Control and Complications Trial,DCCT）和英国前瞻性糖尿病研究（U.K.Prospective Diabetes Study,UKPDS）表明持续的未控制的高血糖能导致血管并发症。动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）的病理改变为在动脉发生粥样硬化以前,常见有内皮细胞损伤或剥脱,内膜通透性增加,少量血浆脂质向内皮下入侵,周围出现单核细胞及平滑肌细胞增生并进入内膜,同时有蛋白聚糖增多,增生的单核细胞及平滑肌细胞在内皮下吞噬脂质形成泡沫样细胞,随后由于脂质入侵增多,在内皮下由脂点、脂纹等发展成为粥样斑块。当血管内皮细胞在一些心血管危险因素如高血脂、高血压、高血糖、高纤维蛋白原血症等的影响下,可出现血管内皮细胞凋亡及功能紊乱,促进AS的进程,因此深入了解ghrelin在内皮细胞的功能将有助于明确其与糖尿病AS之间的内在联系。氧化应激参与多种疾病的病理生理过程,并且可以导致内皮功能受损,有报道称氧化应激是引起胰岛素抵抗、糖尿病和心血管疾病的“共同土壤”。而氧化应激最主要的就是组织或细胞内自由基产生过多,致自由基/抗氧化物平衡失调,自由基种类很多,与氧化应激密切相关的主要为反应性氧化物（Reactive oxygenspecies,ROS）,又称活性氧族。ROS性质极为活跃,易于失去电子（氧化）或夺取电子（还原）,特别是其氧化作用强,具有强烈的引发脂质过氧化、葡萄糖氧化等作用。有学者研究发现ROS通过激活（ADP-核糖基）聚合酶（Poly ADP-ribosepolymerase,PARP）抑制3-磷酸甘油醛脱氢酶（Glyceraldehyde-3-phosphateDehydrogenase,GAPDH）,进而激活蛋白激酶C（Protein kinase C,PKC）,使核转录因子-κB（Nuclearfactor-kappaB,NF-κB）表达上调,而促进血管并发症的发生发展。许多证据表明高血糖可以引起大量ROS产生,直接导致血管内皮细胞损害,以及细胞内核酸、蛋白质表达的错误,这些分子水平的损害在细胞和组织水平,则表现为各系统的并发症。体外实验证明随着浓度增加ghrelin在3T3-L1前脂肪细胞系具有抗氧化酶活性,并且能减少多种细胞内ROS产生。本实验通过研究ghrelin对于体外培养的内皮细胞在高浓度葡萄糖环境下的ROS的产生深入了解其与氧自由基之间的关系,以进一步明确ghrelin的功能。细胞信号转导是研究生物信息或细胞通讯的重要前沿课题,其基本思想已广泛地深入到生命科学和各个领域,信号转导错综复杂,深入了解细胞内信号转导过程对于阐明信号刺激所造成的生物学反应过程及其机制有着十分重要的意义。磷酯酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（Phosphoinositide 3-kinase/Protein kinase B,PI3-Kinase/AKT）通路参与了糖尿病、肿瘤等多种疾病的病理过程,也是体内细胞存活的一条最重要的通路。AKT也叫蛋白激酶B（PKB）,许多生长因子刺激细胞生长与生存反应中均有AKT的高表达和活化,它诱导各种编码抗凋亡蛋白基因表达,或是直接通过信号耦联而不依赖转录方式抑制凋亡发生。Ghrelin作为生长激素的内源性配体,其在高浓度葡萄糖环境下与PI3-Kinase/AKT信号转导通路的关系尚缺乏明确的报导。NF-κB具有广泛的生物学活性,激活后参与许多基因的转录调控,在感染、炎症反应、氧化应激、细胞增生、细胞凋亡等过程中发挥作用。近年研究表明NF-κB与细胞凋亡的关系密切,其参与多种凋亡相关基因的转录调控,在疾病的发生、发展过程中发挥重要作用。NF-κB与细胞凋亡存在双向调节关系:既可抑制细胞凋亡,也可促进细胞凋亡,是抑制凋亡,还是促进凋亡依赖于细胞类型和刺激因素的不同。有报导在内皮细胞ghrelin可以抑制肿瘤坏死因子α（Tumornecrosis factorα,TNFα）诱导的NF-κB活化,但尚未有在高糖环境下的研究。血糖增高可以导致肾、视网膜、神经和血管内皮细胞等凋亡,上述病变与糖尿病并发症和AS加重相关。因此本实验探讨ghrelin对于高浓度葡萄糖环境下血管内皮细胞凋亡的影响及其可能的作用机制,期望能对ghrelin功能的深入研究做出一点贡献。方法1、细胞培养人脐静脉内皮细胞（ECV304）在低糖DMEM培养基和10%胎牛血清中于37℃、5%CO2条件下进行培养,隔天换液,将传至4-5代的细胞用于实验。当细胞呈对数生长后,调整细胞数为1×106/L,接种于6孔培养板或培养皿中,待细胞生长至融合状态后用无血清培养基培养24h使细胞呈静止状态,更换实验用液随机分配为实验组及对照组进行实验。2、吖啶橙（Acridine Orange,AO）和Hoechst33258荧光染色各组细胞按不同实验条件处理后,加入0.01%AO及100μL Hoechst33258工作液染色,荧光显微镜下观察。3、流式细胞仪分析凋亡收集实验各组细胞,70%酒精固定过夜,1000rpm/min离心10min,弃上清,加PBS洗二次,弃上清,吹打管底,加入1000μg/L碘化丙锭（PI）500μL,4℃避光放置30min,流式细胞仪上样检测,CellQuest 3.0采集细胞,MedFit LT 3.0软件分析细胞周期。4、TUNEL检测凋亡各组细胞按不同实验条件处理后,收集各组细胞,制成细胞涂片,4%多聚甲醛固定20min,PBS洗三次,按TUNEL试剂盒操作:标本片加标记缓冲液18μl/片,加TdT和DIG-d-DTP各1μl,湿盒37℃孵箱中标记2h,0.01mol/L TBS洗2min×3次,加封闭液50μl/片,室温30min,抗体稀释液1:100稀释生物素化抗地高辛抗体,50μl/片加至标片上,置湿盒37℃反应30min,0.0lmol/L TBS洗2min×3次,抗体稀释液1:100稀释SABC,混匀后50μl/片,37℃反应30min,0.01mol/L TBS洗5min×4次,DAB显色,苏木素轻度复染,冲洗,封片,显微镜下观察细胞核中有棕黄色颗粒者为凋亡细胞,结果用MetaMorph/DP10/BX41显微图像分析系统分析,以每片取5个最强的染色区域,400倍镜下计数各区域阳性细胞数和总细胞数,计算出每区域阳性细胞百分比,即凋亡指数,以5个区域凋亡指数的平均值作为每组的凋亡指数。每组选取5张代表涂片计数,计数结果平均值作为各组凋亡百分率。5、分光光度计检测caspase-3活性各组细胞按不同实验条件处理后,收集各组细胞,PBS洗二次,2000rpm/min离心5min,去除PBS,沉淀细胞中加入50μl冰冷裂解液和0.5μl DTT,吹打,冰上裂解60min,期间涡旋4次,每次10s,4℃10000rpm/min离心1min,吸取上清至新管中置冰上,测蛋白浓度,各组采用同样蛋白量进行实验,加50μL 2×Reaction Buffer/DTTMix,加5μL caspase-3 substrate（Ac-DEVD-pNA）,37℃4h。分光光度计在400nm波长测定其吸光值,计算OD诱导剂/OD阴性对照确定各组caspase-3活化程度。6、流式细胞仪分析ROS实验各组细胞培养结束后用无血清培养基洗二次,加入HBSS稀释的DCFH-DA（2μmol/L）荧光探针37℃继续孵育20min,DCFH-DA可穿过细胞膜进入细胞,在胞内转化成DCFH,在活性氧存在的条件下被氧化生成荧光物质DCF,以细胞内平均荧光强度反应活性氧水平,培养结束后冰PBS洗脱二次,收集细胞,流式细胞仪进行分析。7、Western-Blot分析磷酸化AKT（Ser473）、NF-κB（p65）蛋白表达实验细胞用冰PBS洗二遍,细胞刷收集细胞,根据蛋白提取试剂盒操作分别提取各组细胞总蛋白及核蛋白,采用Bradford法测定蛋白浓度,每组蛋白质样本40μg在100℃下变性5min,进行10%SDS—PAGE,转膜后5%脱脂奶粉封闭2h,洗膜后加入5%BSA-TBS稀释的抗磷酸化AKT（Ser473）多克隆抗体（1:200）、抗NF-κB（P65）单克隆抗体（1:1000）4℃孵育过夜,再次洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的二抗（1:5000）杂交2h,洗膜后ECL超敏发光液进行显色,每组重复3次,用同样的方法显示内参β—actin条带,结果用Scion Image分析软件对目的条带进行灰度值分析。8、统计学分析应用SPSS 11.5统计软件进行分析,结果用均数±标准差（（?）±s）表示,每组实验重复3次或3次以上,分析方法采用单因素方差分析,S-N-K法两两比较,p＜0.05差异有显著性。结果1、相差显微镜下见正常人脐静脉内皮细胞呈单层生长,呈短梭状或鹅卵石状贴壁紧密排列,细胞为多角形,吖啶橙染色荧光显微镜下观察细胞在正常浓度葡萄糖中培养72h细胞核染色质结构正常,呈均匀荧光;高糖组（33.3mmol/L）可见凋亡细胞,由于失去膜整合性、染色质凝聚和核裂解,胞核致密浓染,呈多种形态;Ghrelin(10-7mol/L)预处理组染色质凝聚、核裂解、致密浓染的细胞较高糖组明显减少。Hoechst 33258荧光染色也得出相同结果。2、流式细胞仪分析凋亡,与对照组相比,高糖（33.3mmol/L）培养72h后增加内皮细胞凋亡率（p＜0.05）,而ghrelin(10-7mol/L)预处理24h后加入高糖（33.3mmol/L）作用72h,与高糖组比较凋亡率明显下降（p＜0.05）。3、TUNEL检测凋亡结果,与对照组相比,高糖（33.3mmol/L）培养72h后增加内皮细胞凋亡率（p＜0.05）,而ghrelin(10-7mol/L)预处理24h后加入高糖（33.3mmol/L）作用72h,与高糖组比较凋亡率明显下降（p＜0.05）。4、高糖（33.3mmol/L）呈时间依赖方式（24h-72h）诱导内皮细胞caspase-3活性增加,用ghrelin(10-7mol/L)预处理24h,高糖（33.3mmol/L）继续作用（24h-72h）,结果ghrelin预处理组与未预处理组比较caspase-3活性减低（p＜0.01）。加入PI3-Kinase特异性抑制剂LY294002（20μmol/L）及ghrelin(10-7mol/L)作用24h,高糖（33.3mmol/L）继续作用72h,结果加抑制剂组与未加抑制剂组比较caspase-3活性增高（p＜0.05）。5、内皮细胞用或不用ghrelin(10-7mol/L)预处理24h后,高糖（33.3mmol/L）继续作用24h、48h,结果与对照组相比,高糖组细胞内ROS分别增加27%、35%（p＜0.05）,ghrelin预处理组细胞内ROS分别增加11%、14%,预处理组比高糖组细胞内ROS明显减少（p＜0.05）。6、不同浓度ghrelin(10-6mol/L、10-7mol/L、10-8mol/L、10-9mol/L)作用内皮细胞30min后磷酸化AKT蛋白表达增加（与对照组比较,p＜0.05）,但后三者之间无差异（p＞0.05）;ghrelin(10-7mol/L)分别作用内皮细胞0min、10min、30min、60min、120min,磷酸化AKT蛋白在ghrelin作用30min后表达达高峰（与对照组比较,p＜0.01）。7、高糖（33.3mmol/L）作用内皮细胞（6h-24h）与对照组比较NF-κB（p65）蛋白表达逐渐增加（p＜0.05）,ghrelin(10-7mol/L)作用内皮细胞6h未见明显NF-κB（p65）蛋白表达,ghrelin(10-7mol/L)加高糖（33.3mmol/L）作用24h较未加ghrelin组比较NF-κB（p65）蛋白表达下降（p＜0.05）。结论1、高浓度葡萄糖作用内皮细胞72h使细胞凋亡增加,ghrelin可以减少高浓度葡萄糖诱导的内皮细胞凋亡。2、随着作用时间延长（24h-72h）高浓度葡萄糖使内皮细胞凋亡相关蛋白caspase-3活性增加,ghrelin可以抑制高浓度葡萄糖诱导的caspase-3活性增加。3、高浓度葡萄糖作用内皮细胞（24h-48h）可以使ROS表达增加,ghrelin可以减少高浓度葡萄糖导致的ROS增加。4、Ghrelin能使内皮细胞AKT（Ser473）磷酸化,抑制PI3-Kinase/AKT通路可以减弱ghrelin抑制caspase-3活性的作用,表明ghrelin的抗凋亡作用至少部分是通过PI3-Kinase/AKT通路实现的。5、随着时间延长（6h-24h）高浓度葡萄糖使内皮细胞NF-κB（p65）蛋白表达逐渐增加,ghrelin可以抑制高浓度葡萄糖诱导的NF-κB（p65）活化。