衣原体RNase H Ⅱ编码基因的克隆与表达及酶的纯化与性质鉴定

论文摘要

衣原体（Chlamydia）是一种可导致多种疾病的病原微生物,它属严格胞内寄生,没有基因水平的遗传操作系统。于其它生物体如大肠杆菌中表达衣原体蛋白质,并在体外鉴定表达蛋白质的生物学功能是目前衣原体分子生物学研究的可行方法。 RNase H 是一类特异性内切 RNA/DNA 杂合体中 RNA 链的酶,其活性依赖于二价金属离子,酶切产物具有 5′-磷酸末端和 3′-羟基末端。RNase H 普遍存在于病毒、原核生物、真核生物。单个的细菌和真核细胞通常含有两个不同的 RNase H,它们彼此之间表现出较少的序列相似性。依据氨基酸序列特征已经将 RNase H 分为两个家族,1 型 RNase H 和 2 型 RNase H。衣原体（Chlamydia pneumoniae）AR39 全基因组序列分析表明衣原体 AR39 没有编码 RNase HI 的基因,但有两个序列不同的编码 RNase HII 的基因:CP0645 和 CP0782。我们分别将 CP0645和 CP0782 编码的酶命名为 CpRNase HIIa 和 CpRNase HIIb。以衣原体全基因组为模板,PCR获得衣原体 AR39 的 CP0645 和 CP0782 基因。采用常规的基因重组技术,即限制性内切酶酶切和 T4-DNA 连接酶连接,将这两个基因克隆到大肠杆菌表达质粒 pET28a 中。DNA 序列分析证实重组质粒含有相应的衣原体基因,其读码框架正确。参照 Novagen 公司提供的操作手册,表达并纯化了重组的 CpRNase HIIa 和 CpRNase HIIb。在大肠杆菌 BL21（DE3）细胞内,表达的 CpRNase HIIa 中可溶形式占 20%,而表达的 CpRNase HIIb 可溶形式占 65%。变性和非变性的镍-树脂（Ni-NTA）亲和层析纯化技术分别用于这两种重组蛋白质的纯化。非变性的镍-树脂（Ni-NTA）亲和层析纯化能够获得有活性的蛋白质,而变性的镍-树脂（Ni-NTA）亲和层析纯化获得的蛋白质没有活性,需要进一步复性才具有活性。简单的透析复性,通过透析溶液的尿素浓度梯度逐步递减,使变性的 CpRNase HIIa 和 CpRNase HIIb 复性,所获得的酶比活性与用非变性纯化获得的蛋白质相当。

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1 前言

1.1 衣原体生物学进展

1.2 RNase H 的研究进展

1.2.1 RNase H 的分类

1.2.2 RNase H 结构与功能的研究进展

1.2.3 RNase H 的功能

1.2.3.1 复制过程中DNA滞后链引物的切除

1.2.3.2 DNA 修复功能

1.2.3.3 RNase H 的转录功能

1.2.3.4 逆转录酶的 RNase H 结构域的功能

1.3 RNase H 的应用

1.3.1 一种独特的DNA扩增方法

1.3.2 设计反义的寡聚脱氧核糖核酸药物

1.3.3 研究病毒的致病机理及抗病毒的药物

1.4 课题研究意义

2 材料与方法

2.1 材料

2.2 衣原体 RNase HⅡ编码基因的克隆、表达及酶的纯化

2.2.1 PCR 扩增衣原体RNase HⅡ的编码基因

2.2.2 表达质粒pET28aCpRNaseHⅡa 和pET28aCpRNaseHⅡb 的构建

2.2.3 衣原体 RNase HⅡ基因的表达

2.2.4 衣原体 RNase HⅡ的纯化

2.2.4.1 变性Ni-NTA亲和纯化和蛋白质复性

2.2.4.2 非变性Ni-NTA亲和纯化

2.2.5 蛋白含量测定的Bandfird方法

2.3 衣原体RNase HⅡ的功能鉴定

2.3.1 衣原体 RNase HⅡ底物的制备

2.3.2 衣原体 RNase HⅡ活性鉴定

2.3.3 金属离子对衣原体RNase HⅡ活性的影响

2.3.4 衣原体RNase HⅡ酶促反应的最适pH值测定

2.3.5 衣原体 RNase HⅡ热稳定性分析

2.3.6 衣原体 RNase HⅡ酶促反应动力学

2.3.7 衣原体 RNase HⅡ酶切位点特征

2.3.8 衣原体 RNase HⅡ酶切底物特异性

3 结果与分析

3.1 衣原体 RNase HⅡ的表达

3.2 衣原体 RNase HⅡ的纯化

3.3 酶的比活性

3.4 动力学常数

3.5 金属离子依赖性

3.6 酶促反应的最适pH值

3.7 酶的热稳定性分析

3.8 酶切位点特异性

3.9 酶切底物特异性

4 讨论

4.1 衣原体RNase HⅡ的表达与纯化

4.2 衣原体RNase HⅡ的功能鉴定

5 展望

5.1 衣原体 RNase HⅡ的晶体结构分析

5.2 建立新型 SNP 检测技术

参考文献

附录

衣原体RNase H Ⅱ编码基因的克隆与表达及酶的纯化与性质鉴定

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