急性肺损伤肺微血管内皮细胞间隙连接蛋白40与血管通透性的关系研究

论文摘要

为探索急性肺损伤（ALI）时肺血管内皮细胞间隙连接蛋白40（Cx40）的表达,连接通道（GJC）功能的状态改变,细胞损伤以及细胞内钙浓度的变化与内皮细胞通透性之间的关系,本研究进行了下列三部分实验。实验一.急性肺损伤兔肺组织通透性改变与Cx40的表达研究目的:观察ALI时家兔肺组织通透性与微血管内皮细胞Cx40表达的关系方法:应用胸部战伤方法建立家兔急性肺损伤模型,将伤后经过简单救治存活下来的家兔随机分为6组,每组6例,每例动物在伤前、伤后6、12、24、48,72小时取动脉血检测IL-8和TNF-α含量;于各时段分别处死动物,取肺组织做HE病理和免疫组织化学染色（Cx40）;伊文思蓝漏出率法测肺微血管通透性;干湿比法测肺的含水量。结果:HE染色见伤肺肺泡腔内大量渗出液体和红细胞的渗出聚集,肺泡隔增厚、断裂、融合,大量白细胞渗出、聚集,毛细血管扩张充血。对侧肺组织肺泡腔内液体渗出、红细胞聚集,肺泡隔内白血病浸润,毛细血管扩张充血。伤后12小时、24小时、48小时和72小时血清中TNF-α和IL-8含量均高于致伤前（p<0.05）。伤后24小时以后各时间点,肺组织含水量均有明显升高（p<0.05）,持续至72小时。肺组织伊文思蓝漏出率随着时间的发展升高（p<0.05）。血管内皮细胞膜Cx40染色较伤前减弱,OD值显著减小（p<0.05）,并与伊文思蓝漏出率呈负相关（γ=-0.934, P<0.05,γ2=0.8723）。实验二.急性肺损伤兔肺微血管内皮细胞通透性改变与Cx40的关系研究目的:观察离体培养的兔肺微血管内皮细胞通透性改变与Cx40表达、GJC功能之间的关系。方法:组织块贴壁法分离、培养兔肺微血管内皮细胞。细胞分为三组,对照组、创伤血清处理组和阻滞剂组。在阻滞剂组,细胞间隙连接通道阻滞剂1-庚醇（0.5 mM）加入到培养液中。1小时后,阻滞剂组和创伤血清组的20%胎牛血清的培养液均被更换为含有20%创伤血清的培养液。对照组则只更换培养液。三组细胞继续孵育6小时后,进入实验观察。分别做划痕实验、Cx40蛋白免疫印迹和单层细胞通透性检测。结果:培养的内皮细胞融合成单层,呈典型的铺路石样镶嵌状排列。Cx40蛋白印迹见创伤血清组与阻滞剂组蛋白表达水平较对照组有明显降低,且两组之间亦不同,阻滞剂组蛋白水平较创伤血清组低（对照组为1±0.07,创伤血清组为0.55±0.15,阻滞剂组为0.43±0.13,n=4,p<0.05）。三组细胞划痕边缘的细胞均被染料LY染色,LY在对照组细胞扩散得最远,显色的周边细胞的数量最多,创伤血清组次之,阻滞剂组显色的细胞数量最少。相邻细胞与边缘细胞的比值的差异具有统计学意义（23±5,11±3 ver 7±2,n=4,p<0.05）。三组细胞伊文思蓝清除率均随着时间的延长而增加,且三组细胞间亦有不同,阻滞剂组清除率高于创伤血清组和对照组。组间差别和时间点差别均有显著性差异。实验三急性肺损伤兔肺微血管内皮细胞Cx40对细胞内Ca++浓度的影响研究目的:观察急性肺损伤时离体培养的兔肺微血管内皮细胞Cx40与内皮细胞损伤、细胞内Ca++浓度变化之间的关系。方法:兔肺微血管内皮细胞的培养和分组同实验二。三组细胞继续孵育6小时后,提取培养液测定LDH含量,加入fluo-3AM负载检测细胞内Ca++钙浓度。结果:通过共聚焦显微镜的观察,三组细胞荧光强度不相同,阻滞剂组荧光最强,对照组最弱。创伤血清组和阻滞剂组细胞内Ca++浓度均显著高于对照组,（nmol/L, 494.8±41.94, 569.8±6.70 versus 158.8±13.09, p<0.05）。创伤血清组和阻滞剂组细胞培养液中LDH含量均显著高于对照组（IU/L, 165.88±16.17, 186.4±24.91 versus 51.31±13.27, p<0.05）,且血清组与阻滞剂组之间的差别亦有统计学意义。此外,三组细胞内Ca++含量与培养液中LDH的浓度还存在正相关关系（γ=0.997, p< 0.05,γ2=0.994）。结论:1.在动物实验中,肺组织通透性升高与肺组织微血管内皮细胞Cx40表达呈负相关关系。在离体培养的肺微血管内皮细胞,富含炎症介质的创伤血清能够抑制Cx40的水平和GJC的功能,与此同时肺血管内皮细胞通透性升高,二者存在负相关关系,Cx40水平和GJC功能的下降能够明显增加肺微血管内皮细胞的通透性。2.创伤因素所致的Cx40水平和GJC功能的抑制,与内皮细胞胞浆内Ca++浓度和和细胞损伤是负相关关系。3.创伤发生后炎症介质可能是通过抑制Cx40水平和GJC功能,减少细胞间Ca++的流动和调节,升高细胞内Ca++浓度,使血管内皮细胞通透性增加。这为预防和减轻急性肺损伤提供一个新的思路。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 文献回顾
• 一、细胞间隙连接通道和蛋白
• 二、急性肺损伤时肺血管内皮通透性改变机制
• 1. 肺微血管内皮细胞的通透性及其调节特点
• 2. 急性肺损伤时引起肺血管内皮通透性增加的机制
• 3. 急性肺损伤时影响肺血管内皮通透性的几个因素
• 三、蛋白激酶C 对肺微血管内皮通透性的影响
• 1 PKC 结构特征
• 2 急性肺损伤时由PKC 介导的信号传导通路
• 3 肺损伤时PKC 介导肺微血管内皮细胞通透性增加的机制
• 正文
• 实验一 急性肺损伤兔肺组织通透性改变与CX40 的表达研究
• 1 材料
• 1.1 试剂
• 1.2 仪器
• 1.3 动物
• 1.4 常用溶液的配制
• 2 方法
• 2.1 急性肺损伤动物模型的建立
• 2.2 急性肺损伤兔肺组织微血管内皮细胞Cx40 的表达
• 2.3 急性肺损伤兔肺组织通透性的改变研究
• 2.4 数据的检测与统计学分析
• 3 结果
• 4 讨论
• 实验二 急性肺损伤兔肺微血管内皮细胞通透性改变与CX40 的关系研究
• 1 材料
• 1.1 试剂
• 1.2 仪器
• 1.3 动物
• 1.4 常用溶液的配制
• 2 方法
• 2.1 肺微血管内皮细胞的分离与培养
• 2.2 肺微血管内皮细胞分组
• 2.3 肺微血管内皮细胞间隙连接通道蛋白Cx40 的测定
• 2.4 肺微血管内皮细胞GJC 功能的改变
• 2.5 肺微血管内皮细胞通透性改变的测定
• 2.6 数据的检测与统计学分析
• 3 结果
• 4 讨论
• 实验三 急性肺损伤兔肺微血管内皮细胞CX40 对细胞内CA++浓度的影响研究
• 1 材料
• 1.1 试剂
• 1.2 仪器
• 2 方法
• 2.1 肺微血管内皮细胞胞浆内钙浓度的测定
• 2.2 肺微血管内皮细胞损伤程度的判定
• 2.3 数据的检测与统计学分析
• 3 结果
• 4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 个人简历和研究成果
• 致谢