高血压患者肠系膜动脉平滑肌细胞BKCa对NO敏感性的改变及机制的研究

论文摘要

目的：高血压（hypertension, HT）是冠心病、脑中风等众多心血管疾病的最大的独立危险因素,对人类健康影响极大,有效的降压可显著降低患者的死亡率。在高血压疾病的进程中,常伴随着血压调节的生理因素的异常,包括交感神经和血管活性物质如一氧化氮（nitric oxide, NO）水平的改变等。小动脉张力增高,外周血管阻力持续升高是高血压的主要表现,其机制至今尚未完全阐明。肠系膜动脉作为人体主要的内脏血管,在全身的动脉中所占比例最大,是形成外周阻力的主要血管,对循环中的活性物质敏感,对血压的调节具有重要意义。大电导钙激活钾通道（large-conductance calcium-activated potassium channels, BKCa）在血管平滑肌细胞膜上分布广泛,是血管平滑肌上主要的负反馈调节器,在调节血管平滑肌张力机制中起着重要作用。NO是一种内源性的血管舒张因子,也是调节心血管系统功能的重要的细胞信使分子,可通过激活BKca发挥其调节作用。目前关于NO与心血管疾病关系的研究多集中于高血压时NO分泌量变化的报道,而高血压状态下BKca对NO的敏感性是否有变化较少报道,深入讨论这些问题对揭示高血压发生的病理生理机制具有重要意义。本实验应用膜片钳单通道电流记录、实时荧光定量PCR和Western blot技术,观察高血压患者肠系膜动脉血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells, VSMCs） BKCa通道对NO的敏感性变化,以及测定在NO-BKca通路上与这种变化相关调控因子sGCα、sGCβ和cGKI的mRNA与蛋白表达水平的变化,进一步探讨原发性高血压发生发展过程中可能的离子通道功能变化,为高血压发病机制的阐明提供更多的实验依据。方法：（1）膜片钳实验：35例接受腹部手术的患者分为两组：高血压组（hypertension group,HT）20例,血压正常组（normotension group, NT）15例。取其切除的肠系膜动脉,纵向剖开剪成2 mm×2 mm的组织条块,置于酶液中进行两步消化。选取贴壁良好,折光性强,具有较强立体感,表面光滑的平滑肌细胞进行实验。取细胞置于对称性高钾溶液（[K+]o:[K+]i=140:140mM）中,用单通道膜片钳技术记录电流,所得电流通过膜片钳放大器（CEZ-2200）放大,滤波（1 KHz）后输入计算机,经pClamp 6.0软件采集电流,Clampfit10.1软件系统进行数据分析。在细胞贴附式膜片（cell-attached）和内面向外式膜片（inside-out）上观察NO对BKca通道的影响,并比较HT组和NT组BKca通道对NO敏感性的变化。（2） Real-time PCR实验：①32例接受腹部手术的患者分为两组：HT组12例,NT组20例,取其切除的肠系膜动脉作为研究对象；②提取肠系膜动脉总RNA,通过逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）构建标准品和标准曲线；③以GAPDH为内参照基因,采用SYBR Green I法实时荧光定量PCR技术检测高血压患者和正常血压患者肠系膜动脉平滑肌sGCα、sGCβ和cGKI基因mRNA水平。（3） Western blot实验：①32例HT组16例,NT组16例,取接受腹部手术患者切除的肠系膜动脉作为研究对象；②首先提取肠系膜组织总蛋白并测定样品蛋白浓度,将样品总蛋白上样于预灌制的12%聚丙烯酰胺凝胶中,60V,40分钟,过了浓缩胶后改为120V,40分钟进行电泳,然后恒流（390mA）转印50分钟,5%脱脂奶粉4°C封闭过夜。次日室温下将膜用sGCα、sGCβ和cGKI一抗孵育5h,洗膜之后用羊抗兔IgG二抗（1：5000）室温孵育l h,最后显色成像,采用Quantity One软件对sGCα、sGCβ和cGKI特异性条带进行半定量分析,同时用GAPDH蛋白的表达量做为内对照。结果：（1）急性酶分离的肠系膜动脉平滑肌细胞BKca通道的基本特性：①在对称性高钾溶液中,inside-out上,记录到的肠系膜动脉平滑肌细胞BKca通道电导值为200.0±6.97 pS（n=9）,具有电压依赖性和钙敏感性。②在outside-out下（Vm=+30mV）,200 nM的IbTX几乎能够完全阻断通道活动。（2）HT组与NT组BKca通道对NO敏感性变化的比较：①在cell-attached（Vm=+40mV）下,给予NO供体硝普钠（sodium nitroprusside, SNP） 100μM后NT组BKca通道开放概率（NPo）由0.007±0.002增至0.015+0.004（n=9,P<0.05）,平均开放时间由5.339±1.389（ms）增至10.241±2.290（ms）（n=9,P<0.05）,平均关闭时间由1289.492±299.291（ms）缩短至901.174+176.264（ms）（n=9,P<0.05）；给予SNP 100μM后,HT组BKca通道平均开放时间由6.010±1.557（ms）增至9.356±1.482（ms）（n=9,P<0.05）,通道开放概率和平均关闭时间均无统计学上差异。电流幅值用药前后无明显变化。②在inside-out （Vm=+40 mV）下,给予SNP后NT组BKca通道开放概率（NPo）由0.004±0.001增至0.014±0.003（n=9,P<0.05）,平均开放时间由4.837±0.978（ms）增至6.731±1.555（ms）（n=9,P<0.05）；平均关闭时间由1852.972±587.168（ms）缩短至762.020±213.296（ms）（n=9,P<0.05）。给予SNP 100μM后,HT组BKca通道平均开放时间由8.110±1.99（ms）增至10.271±2.345（ms）（n=9,P<0.05）,通道开放概率和平均关闭时间均无统计学上差异。电流幅值用药前后无明显变化。③与NT组相比,HT组给予SNP后BKca通道开放概率增加倍数和平均关闭时间减少倍数均降低。（3）HT组sGCαsGβ和cGKI基因mRNA的变化：①总RNA质量：提取的总RNA通过紫外分光光度仪测量,A260/A280在1.80-2.10之间,A260/A230在1.90-2.20之间,浓度大于100 ng/ul,通过1%琼脂糖凝胶电泳得出,28S带和18S带明显,灰度比大于1,5S带不明显,无拖尾；②标准曲线和熔解曲线：标准曲线线性关系良好,相关系数R2>0.99。sGCa基因的标准曲线为y=-0.30x+7.28, R2=0.999; sGCβ基因的标准曲线为y=-0.30x+7.44,R2=0.998; cGKI基因的标准曲线为y=-0.29x+7.60, R2=1.000; GAPDH基因的标准曲线为y=-0.30x+7.40,R2=0.999。熔解曲线呈明显单峰状,退火温度与预测值基本一致；③HT组和NT组sGCα/GAPDH比值分别为0.1035±0.0322 （n=9）,0.1843±0.0210 （n=15）, HT组sGCa基因mRNA水平低于NT组,P<0.05；HT组和NT组sGCβ/GAPDH比值分别为0.0393±0.0064 （n=5）,0.0712±0.0103 （n=8）, HT组sGCβ基因mRNA水平低于NT,P<0.05；HT组和NT组cGKI/GAPDH比值分别为0.0271±0.0108 （n=8）,0.0706±0.0164 （n=7）, HT组cGKI基因mRNA水平低于NT组,P<0.05; （4）HT sGCα、sGCβ和cGKI蛋白表达量的变化：HT组和NT组sGCα、sGCβ和cGKI蛋白的相对表达量分别为0.5510+0.0220（n=15）,0.6483±0.0468 （n=9）;0.4583±0.0209 （n=16）,0.7690±0.0392 （n=15）; 0.5418±0.1028 （n=13）,0.6692±0.0249 （n=11）; HT组sGCα、sGCβ和cGKI蛋白表达水平低于NT组,P<0.05。结论：（1）在cell-attached和inside-out构型上,NO对人肠系膜动脉平滑肌细胞BKca均有激活作用。（2）在cell-attached和inside-out构型上,HT组BKca通道对NO敏感性降低。（3）在高血压疾病状态下,NO-BKca通路上sGCα、sGCβ和cGKI基因mRNA下调。（4）在高血压疾病状态下,NO-BKca通路上sGCα、sGCβ和cGKI蛋白表达下调。在高血压疾病状态下NO-BKca通路上sGCα、sGCβ和cGKI基因和蛋白表达水平的下调可能是引起BKca对NO的反应性降低的原因。

论文目录

• Ca对NO敏感性的改变及机制的研究'>1 高血压患者肠系膜动脉平滑肌细胞BK_Ca对NO敏感性的改变及机制的研究
• 1.1 中文摘要
• 1.2 英文摘要
• 1.3 前言
• 1.4 材料与方法
• 1.5 结果
• 1.6 讨论
• 1.7 结论
• 1.8 参考文献
• 1.9 英汉缩略词对照表
• 2 致谢
• 3 一氧化氮心血管作用的研究进展（综述）
• 参考文献