拟南芥MAP65-6和TUA-6基因转化烟草的初步研究

论文摘要

植物细胞形态建成（cell morphogenesis）是植物的生长发育过程中细胞发挥特殊功能的必要条件,细胞骨架在细胞形态建成中发挥关键作用。细胞骨架包括微管、微丝和中间纤维,其中微管在细胞分裂、分化、细胞形态决定及胞内物质运输等生理活动中起重要作用。植物细胞有不同于动物细胞的微管阵列,如周质微管、早前期带、纺锤体微管和成膜体微管。在植物细胞的形态建成中,微管阵列会依次转换。微管阵列的转换需微管蛋白（tubulin）和微管相关蛋白（microtubule-associated protein）的参与。本文通过农杆菌介导的叶盘转化法将MAP65-6-GFP、GFP-TUA-6和TUA-6-GFP转入烟草植株。针对烟草NC89,进行遗传转化体系的改进。改进后的方法：烟草子叶先在黑暗条件下预培养2d,用OD600为0.7的农杆菌侵染5min,再在黑暗条件下共培养2d,用合理有效的脱菌方式进行脱菌,再分别转入含有不同激素和抗生素浓度梯度的愈伤诱导培养基、分化培养基和生根培养基中进行筛选。总共获得了88株转化植株。对36株MAP65-6-GFP转化烟草植株进行PCR检测,17株为阳性植株,转化率达47%。挑选其中的5株阳性植株进行Southern blot检测,有3株有杂交信号。取杂交信号强的植株用激光共聚焦显微镜观察,发现MAP65-6-GFP主要定位在细胞质和周质微管中。在33株(GFP-TUA-6转化烟草植株中,12株为PCR检测阳性植株,转化率达36%。挑选其中的5株阳性植株进行Southern blot检测,有3株有杂交信号。取杂交信号强的植株用激光共聚焦显微镜观察,发现GFP-TUA-6主要定位在周质微管中。在19株TUA-6-GFP转化烟草抗性植株中,4株为PCR检测阳性植株,转化率仅为21%。然后再进行Southern blot检测,有3株有杂交信号。激光共聚焦显微镜观察发现,TUA-6-GFP在根的细胞质和周质微管中荧光都很强。本研究获得的荧光强度高且稳定的MAP65-6-GFP转基因株系将为进一步研究MAP65-6如何调节微管阵列功能的发挥奠定基础；而GFP-TUA一6和TUA-6-GFP转基因株系将作为研究微管的活体探针,这为进一步研究周质微管在细胞形态建成中的动力学机制提供了材料。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表及其英汉对照
• 前言
• 第一章 文献综述
• 第一节 植物细胞骨架的结构特征与功能
• 1 细胞骨架的概述
• 2 植物细胞骨架的结构特征
• 3 植物细胞骨架的功能
• 4 活体探针在植物细胞骨架研究中的应用
• 第二节 植物微管蛋白
• 1 植物微管蛋白的概述
• 2 植物微管蛋白的功能
• 3 植物微管蛋白家族
• 第三节 植物微管相关蛋白
• 1 植物微管相关蛋白的概述
• 2 植物微管相关蛋白的功能
• 3 植物MAP65家族
• 第二章 转拟南芥MAP65-6和TUA-6烟草植株的获得
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 3 实验结果
• 3.1 pMAP65-6-GFP、pGFP-TUA-6及pTUA-6-GFP的农杆菌转化
• 3.2 预培养时间的选择
• 3.3 农杆菌的菌液浓度及侵染时间的选择
• 3.4 共培养时间的选择
• 3.5 脱菌方法的选择
• 3.6 从诱导愈伤到长成植株的各阶段培养基激素浓度的选择
• 3.7 抗生素浓度的选择
• 3.8 转基因植株的获得
• 3.9 转基因植株PCR分子检测
• 3.10 转基因植株的Southern blot分析
• 3.11 转基因植株的荧光显微镜检测
• 4 讨论
• 第三章 融合蛋白MAP65-6-GFP,GFP-TUA-6和TUA-6-GFP在烟草细胞中的定位
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 3 结果与讨论
• 3.1 MAP65-6-GFP转基因烟草的激光扫描共聚焦显微镜观察
• 3.2 GFP-TUA-6转基因烟草的激光扫描共聚焦显微镜观察
• 3.3 TUA-6-GFP转基因烟草的激光扫描共聚焦显微镜观察
• 全文结论
• 参考文献
• 附录
• 攻读硕士学位期间发表的研究论文
• 致谢