论文摘要
背景越来越多的研究证据表明血凝素样氧化低密度脂蛋白受体-1（lectin-like oxidized low density lipoprotein receptor-1,LOX-1）与动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）形成密切相关,其直接证据来源于LOX-1在人和动物动脉粥样斑块中的高表达。LOX-1正逐渐成为心血管疾病的生物标记物和一个潜在的治疗靶点,抑制LOX-1的表达将有利于防止动脉粥样硬化的形成。RNA干扰（RNA interference,RNAi）是将外源或内源性的双链RNA（double strand RNA,dsRNA）导入细胞而引起与dsRNA同源的mRNA降解,进而抑制其相应的基因表达的技术,具有高度的序列特异性、高效性、长效性等优点,已成为基因功能研究和基因治疗研究的重要工具。在动脉粥样硬化的发生发展过程中,循环单核细胞趋化、聚集、黏附到血管内皮是AS的最早期事件,由血管内皮细胞产生的趋化因子和黏附分子在介导循环单核细胞趋化、聚集、黏附到血管内皮的过程中起了至关重要的作用。氧化低密度脂蛋白（oxidized low densitylipoprotein,Ox-LDL）是动脉粥样硬化最明确的危险因子之一,Ox-LDL可能通过诱导内皮细胞表达黏附分子和趋化因子,从而募集单核细胞向血管内皮黏附。Fractalkine作为一种能趋化单核细胞的新发现的趋化因子,Ox-LDL能否诱导和上调Fractalkine的表达及其信号传导通路尚不清楚。单核/巨噬细胞源性泡沫细胞的形成是动脉粥样硬化的标志之一,巨噬细胞通过清道夫受体介导对氧化修饰脂蛋白的摄取是泡沫细胞形成的关键。LOX-1和CD36都是巨噬细胞中Ox-LDL的主要受体,但是,在巨噬细胞摄取Ox-LDL变成泡沫细胞的过程中,LOX-1和CD36所起的作用可能有所不同。在巨噬细胞中Ox-LDL能上调CD36的表达并且能够促进对Ox-LDL的摄取,但Ox-LDL对巨噬细胞中LOX-1表达的调节尚有争议。目的（1）构建一个靶向LOX-1基因的发卡样siRNA（short hairpin smallinterference RNA,shRNA）真核表达载体,并检测其对LOX-1基因的抑制效应,为进一步利用RNA干扰技术防治动脉粥样硬化提供一种研究基础。（2）探讨Ox-LDL能否诱导和上调趋化因子Fractalkine和MCP-1的表达及其细胞信号传导通路,为防治AS提供一个可能的治疗靶点。（3）探讨巨噬细胞中LOX-1是否参与了Ox-LDL对清道夫受体CD36表达的调节。方法（1）根据siRNA的设计原则,以LOX-1为靶基因设计并合成小发卡结构两端配对的siRNA寡核苷酸链,再经变性、复性后形成双链LOX-1 shRNA。采用DNA重组技术,将LOX-1 shRNA双链与线性化pGenesil-1质粒表达载体连接,脂质体法转染进人脐静脉内皮细胞（HUVECs）,半定量RT-PCR方法检测LOX-1 mRNA的表达,western-blot方法检测LOX-1蛋白水平表达。（2）分别用25 mg/L、50 mg/L、100 mg/L的Ox-LDL与培养的HUVECs共孵育24小时,半定量RT-PCR方法检测LOX-1、Fractalkine和MCP-1的mRNA表达;western-blot检测LOX-1和Fractalkine蛋白表达;ELISA方法检测MCP-1含量。（3）预先对HUVECs转染pGenesil-1LOX-1shRNA和用PD98059预处理HUVECs,再用50 mg/L的Ox-LDL刺激,半定量RT-PCR方法检测LOX-1、Fractalkine和MCP-1的mRNA表达;western-blot检测LOX-1和Fractalkine及ERK1/2和p-ERK1/2蛋白表达;ELISA方法检测MCP-1含量。（4）100ng/ml的佛波酯与人单核细胞株THP-1共孵育72小时,诱导其分化为巨噬细胞。预先用CD36特异性中和抗体阻断巨噬细胞中CD36的作用,再分别用25mg/L、50mg/L、100mg/L的Ox-LDL共孵育24小时,半定量RT-PCR方法检测细胞LOX-1和CD36的mRNA表达,western-blot检测LOX-1和CD36的蛋白表达。（5）在RNA干扰抑制巨噬细胞LOX-1表达基础上预先用CD36特异性中和抗体阻断CD36的作用,再用50mg/L的Ox-LDL共孵育24小时,半定量RT-PCR方法检测细胞LOX-1和CD36的mRNA表达,western-blot检测LOX-1和CD36的蛋白表达。（6）分别加入CD36中和抗体和LOX-1基因沉默后,用Ox-LDL（50 mg/L）刺激巨噬细胞,分别在0h、6h、12h、24h、48h用半定量RT-PCR方法检测细胞LOX-1和CD36的mRNA表达。结果（1）成功合成了发卡样LOX-1基因的RNA干扰表达载体;LOX-1基因的发卡样siRNA表达载体转染人脐静脉内皮细胞后,LOX-1 mRNA和蛋白的表达水平显著下调（p<0.01）。（2）Ox-LDL能够呈浓度依赖性上调LOX-1、Fractalkine和MCP-1的基因和蛋白水平表达,与对照组比较p<0.01。而用RNA干扰抑制LOX-1的表达后,显著抑制了Ox-LDL（50 mg/L）刺激HUVECs引起的Fractalkine和MCP-1的基因和蛋白表达,与对照组比较p<0.01。（3）用PD98059预处理和用RNA干扰抑制LOX-1的表达,显著抑制了Ox-LDL（50 mg/L）刺激HUVECs引起的p-ERK1/2蛋白表达,同时也抑制了Fractalkine和MCP-1的基因表达。（4）100ng/ml的佛波酯与人单核细胞株THP-1共孵育72小时能成功诱导其分化为巨噬细胞。（5）阻断CD36后,加入不同浓度Ox-LDL刺激巨噬细胞24小时,其LOX-1和CD36的mRNA和蛋白表达呈浓度依赖性上调（p<0.01）,未加CD36中和抗体组与对照组（只加CD36中和抗体,未加Ox-LDL）比较,LOX-1和CD36的mRNA及蛋白表达差异无显著性（p>0.05）。（6）同时抑制LOX-1和阻断CD36的作用后,显著抑制了Ox-LDL（50mg/L）刺激后CD36的mRNA和蛋白表达,与对照组比较p<0.01。（7）用CD36特异性中和抗体后,LOX-1 mRNA表达在6小时就已经显著增加,24小时达最高表达,48小时的时候开始有下降趋势,CD36 mRNA表达在6小时亦显著增高,以后在12小时和24小时继续增加,至48小时达最高表达,与0h比较p<0.01;LOX-1基因沉默后,CD36 mRNA的表达在12小时才开始表达增加（与0h比较p<0.05）,24小时表达显著增加（与0h比较p<0.01）,48小时达最高表达（与Oh比较p<0.01）。结论（1）成功构建了能有效抑制LOX-1表达的发卡样LOX-1基因RNA干扰表达载体。（2）氧化低密度脂蛋白能够呈浓度依赖性上调人脐静脉内皮细胞中趋化因子Fractalkine和MCP-1的表达;这种诱导作用与活化LOX-1—ERK1/2的信号传导途径有关。（3）氧化低密度脂蛋白能够呈浓度依赖性上调THP-1源巨噬细胞中CD36的表达,LOX-1参与了这一调节过程,且主要在Ox-LDL刺激后的早期阶段起重要作用。
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标签：干扰论文; 人脐静脉内皮细胞论文; 氧化低密度脂蛋白论文; 单核细胞趋化蛋白论文; 细胞外信号调节激酶和论文; 清道夫受体论文; 巨噬细胞论文;