水稻黑条矮缩病抗性鉴定技术和遗传研究

论文摘要

水稻黑条矮缩病（Rice black-streaked dwarf disease）是一种主要由灰飞虱（Laodephax striatellus Fallen）以持久性不经卵方式传播的恶性水稻病毒病。发掘抗性基因和培育抗性品种是解决这类病毒病害的根本策略,但受制于品种抗性人工接种鉴定方法的缺乏,水稻黑条矮缩病品种抗性的遗传学研究和育种实践一直进展较慢。为此,本研究在破解了南方水稻黑条矮缩病毒假阳性毒源干扰、病毒毒源保存和灰飞虱携带水稻条纹病毒干扰等技术难点的基础上,构建了高效引发水稻黑条矮缩病的人工接种鉴定方法。同时,采用多年多点方法在重病区抗鉴圃中对水稻品种和资源进行水稻黑条矮缩病的抗性鉴定,利用上述人工接种鉴定方法对筛选出的抗性品种进行进一步的抗性确认,并分析其对水稻黑条矮缩病的抗性特征。将抗性品种与感病品种构建分离群体,采用人工接种鉴定方法分析其遗传模式,同时利用分子标记分析方法构建遗传连锁图谱,对抗性基因进行了定位研究。主要结论如下。1.建立一种快速、灵敏检测的水稻黑条矮缩病毒的逆转录环介导等温扩增方法（Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification, RT-LAMP）。该方法可排除南方水稻黑条矮病毒的干扰而特异的检测植物和飞虱体内的水稻黑条矮缩病毒,其灵敏性与RT-PCR基本一致,但检测结果易于判定。这一方法的建立成功破解了水稻黑条矮缩病品种抗性的人工接种鉴定方法中南方水稻黑条矮缩病毒假阳性毒源干扰。2.发明了一种利用灰飞虱从冻存病叶中获得水稻黑条矮缩病毒的方法。以冷冻保存的水稻黑条矮缩病罹病植株叶片对灰飞虱进行饲毒,随后接种感病水稻品种,结果发现灰飞虱可从冻存病叶上获得并传播水稻黑条矮缩病毒,且获毒能力和传毒能力与未冻存病叶处理相比无显著性差异。这表明从冻存病叶上获得水稻黑条矮缩病毒的灰飞虱可以应用于品种抗性人工接种鉴定。3.利用梯度试验分别研究了病毒在介体体内的循回时间、接种时间、接种强度、水稻接种苗龄4个因素对鉴定效果的影响。结果显示,病毒在介体体内的循回时间为12-15d或21-24d条件下,鉴定效果优于8-11d和16-17d处理；接种48-72h条件下,鉴定效果优于12-24h处理；有效接种强度4-20虫/苗条件下,鉴定效果优于1-3虫／/苗处理；水稻接种苗龄0.5-2.5叶龄条件下,鉴定效果优于2.5-3.5叶龄处理。由此构建了水稻抗黑条矮缩病人工接种鉴定方法：循回时间为12-15d、接种时间48-72h、有效接种强度4-20虫/苗和水稻接种苗龄0.5-2.5叶。在此条件下对不同抗性表现的水稻品种进行鉴定,其鉴定效果与重病区田间鉴定效果无显著性差异,表明所构建的水稻黑条矮缩病品种抗性人工接种鉴定方法能客观地反映水稻品种对水稻黑条矮缩病的抗性水平。4.在常年水稻黑条矮缩病重发的地区江苏省建湖县、盐都县和灌云县分别建立抗性鉴定圃,对主栽品种和资源材料进行了多年多点田间抗性鉴定,发现水稻品种对水稻黑条矮缩病的田间抗性在不同地点和不同年份间并不相同,尽管不同品种对水稻黑条矮缩病表现出一定差异,但没有发现免疫或高抗的品种。一份来自越南的籼稻资源材料特特勃在两年三点的田间试验中表现出抗病和中抗的抗性水平,可望作为抗性资源运用于针对水稻黑条矮缩病的抗性育种。5.利用人工接种鉴定、非嗜性测验及抗生性测验分析了特特勃对水稻黑条矮缩病和传毒介体灰飞虱的抗性特征,结果表明特特勃对水稻黑条矮缩病表现为抗病,抗虫性鉴定发现特特勃仅表现出弱非嗜性,而无抗生性。综合抗病性和抗虫性表现,特特勃对水稻黑条矮缩病的抗性主要来自于对病毒本身的抗性,而不是对传毒介体灰飞虱的抗性。采用人工接种鉴定方法对淮稻5号/特特勃构建的F2：3家系进行水稻黑条矮缩病抗性遗传分析,发现其对水稻黑条矮缩病的抗性为数量性状,可能由1-2个主效基因控制。6.在842对微卫星标记中筛选获得在淮稻5号和特特勃间存在多态性标记160个（多态性频率19%）,从中选用127个标记对淮稻5号/特特勃F2群体的138个株系进行分析,构建覆盖基因组2179.6cM的水稻遗传连锁图谱,标记间平均间距为17.16cM。采用基于复合区间作图法的软件Windows QTL Cartographer V2.5对构建的遗传图谱和之前获得表型数据进行分析,从淮稻5号/特特勃的F2群体检测出2个水稻黑条矮缩病抗性QTL,分别命名为qRBSDV-3和qRBSDV-11.其中qRBSDV-3位于第3染色体的RM5626-RM7097之间,LOD值为4.07,贡献率为17.5%。qRBSDV-11位于第11染色体的RM202-RM7120之间,LOD值为2.21,贡献率为12.4%,两抗性QTL均来自于抗病品种特特勃。通过图谱比对表明本研究获得的两个抗性QTL是新的水稻黑条矮缩病抗性位点。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一部分 文献综述
• 第一章 水稻黑条矮缩病及其在我国的发生现状
• 1 分类地位
• 2 病毒粒子的基本特征
• 3 病毒粒子在宿主植物和介体飞虱体内的分布
• 4 病毒的基因组结构
• 5 寄主范围及分布
• 6 传播介体和病害症状
• 7 南方水稻黑条矮缩病
• 8 病害发生规律与防治措施
• 第二章 水稻黑条矮缩病品种抗性的研究进展
• 1 抗病品种和资源材料的发掘与鉴定
• 2 抗性的遗传学研究
• 3 抗性新材料的创制
• 4 本研究的目的和意义
• 第二部分 研究内容
• 第三章 水稻黑条矮缩病品种抗性人工接种鉴定方法的建立
• 第一节 RT-LAMP法快速鉴定水稻黑条矮缩病毒方法的建立
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 RT-LAMP反应体系优化
• 2.2 RT-LAMP与RT-PCR灵敏性比较以及用荧光染料检测RT-LAMP产物
• 2.3 特异性检测
• 2.4 RBSDV田间疑似病株检测
• 3 讨论
• 第二节 冷冻法保存水稻黑条矮缩病毒
• 1 材料与方法
• 1.1 病毒来源
• 1.2 传毒介体的筛选
• 1.3 灰飞虱从冻存病叶中的获毒能力
• 1.4 灰飞虱从冻存病叶获毒后的传毒能力
• 1.5 传毒介体中水稻黑条矮缩病毒的检测
• 2 结果与分析
• 2.1 小麦绿矮病样本的筛选
• 2.2 灰飞虱从冻存病叶中的获毒能力
• 2.3 灰飞虱从冻存病叶获毒后的传毒能力
• 3 讨论
• 第三节 水稻黑条矮缩病品种抗性的人工接种鉴定方法的建立
• 1 材料与方法
• 1.1 水稻材料和接种体的准备
• 1.2 人工接种鉴定最佳条件筛选
• 1.3 人工接种鉴定与重病区田间鉴定效果的比较
• 1.4 数据统计分析
• 2 结果与分析
• 2.1 人工接种鉴定方法的最佳条件筛选
• 2.2 人工接种鉴定与重病区田间鉴定效果的比较
• 3 讨论
• 第四章 抗水稻黑条矮缩病品种的筛选及抗性遗传研究
• 第一节 抗水稻黑条矮缩病品种资源的筛选鉴定
• 1 材料方法
• 1.1 鉴定圃的选择
• 1.2 供试品种的抗性鉴定
• 1.3 有效接种虫量的调查
• 1.4 病害调查
• 1.5 抗性分级
• 2 结果
• 2.1 有效接种虫量
• 2.2 抗性鉴定结果
• 3 讨论
• 第二节 特特勃对水稻黑条矮缩病的抗性特征及其遗传分析
• 1 材料与方法
• 1.1 供试材料
• 1.2 传毒介体的筛选
• 1.3 水稻黑条矮缩病品种抗性人工接种鉴定
• 1.4 灰飞虱抗性鉴定
• 2 结果与分析
• 2.1 特特勃对水稻黑条矮缩病和传毒介体灰飞虱的抗性表现
• 2.2 特特勃对水稻黑条矮缩病的抗性遗传分析
• 3 讨论
• 第三节 特特勃对水稻黑条矮缩病的抗性QTL分析
• 1 材料与方法
• 1.1 作图群体与引物
• 1.2 DNA提取（CTAB法）
• 1.3 PCR扩增
• 1.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 1.5 遗传连锁图谱的构建
• 1.6 QTL分析
• 2 结果与分析
• 2.1 多态性分析
• 2.2 遗传连锁图谱的构建
• 2.3 水稻黑条矮缩病抗性QTL的检测
• 3 讨论
• 第五章 全文总结
• 1 全文结论
• 2 本研究创新之处
• 参考文献
• 附录
• 在读博士期间发表论文
• 致谢