论文摘要
细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4 （CTLA-4）是活化的T淋巴细胞表面的一种与免疫信号传递有关的膜蛋白分子,由特征性的IgV胞外区、跨膜区和胞内区三部分构成。CTLA-4能与CD28分子竞争结合B7分子,从而抑制T细胞活化,因此完整CTLA-4分子对免疫应答起负调节作用。单独的IgV胞外区虽能与B7分子结合,但不具有免疫负调节,而能促进抗原提呈细胞（APC）对靶抗原的加工提呈,有可能成为一种新型的分子免疫佐剂。本研究首先从犬外周血分离淋巴细胞,经ConA刺激活化后提取总RNA,然后用RT-PCR扩增出大约400bp的IgV胞外区序列,将其克隆入T载体后进行测序,结果显示其核苷酸序列与已发表的CTLA-4全基因序列的胞外区同源性达到99.2%,在氨基酸水平同源性为98.4%,与B7分子结合的六肽基序（MYPPPY）没有变化。然后将目的片段亚克隆入原核表达载体pQE-31中,在大肠杆菌中成功表达了约17KDa的重组蛋白,并用亲和层析进行了纯化。为了研究犬CTLA-4胞外区的分子免疫佐剂作用,参考文献报道的方法,用DNAStar软件包中的Protean程序对犬细小病毒（CPV）VP2蛋白进行亲水性和免疫原性分析,选择亲水性和抗原指数高的293-520位氨基酸区域（命名为VP2S）,利用Primer Premier5.0软件设计一对引物,以含CPV VP2基因的重组质粒为模板,扩增出预期大小的VP2S片段,将其分别定向克隆入原核表达载体pQE-31和pQE-31-CTLA4,构建成重组表达质粒pQE-31-VP2S和pQE-31-CTLA4-VP2S。结果在大肠杆菌中成功表达了约29KDa的VP2S和42KDa的CTLA4-VP2S,Western-blotting结果显示,两种重组蛋白能被CPV抗血清识别,证明目的蛋白的表达正确。用亲和层析分别对VP2S和CTLA4-VP2S进行纯化,以纯化的蛋白质免疫小鼠,用间接ELISA测定两种抗原免疫小鼠血清中的抗体水平,结果CTLA-4-VP2S免疫组的抗体产生时间及抗体滴度高峰出现时间均早于VP2S免疫组,ELISA抗体滴度为1:100000,是VP2S免疫组的100倍。血凝抑制的抗体效价的变化规律与ELISA效价一致,说明CTLA-4胞外区能作为分子免疫佐剂促进抗体应答,这对犬细小病毒病的治疗与预防有及其重要的意义。
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