BRCAA1基因对胃癌MGC-803细胞的作用机制研究

论文摘要

目的:本研究旨在探讨brcaa1基因敲除后对胃癌MGC-803细胞的作用机制。方法:根据brcaa1基因序列设计shRNA,构建brcaa1基因shRNA载体。用FuGene HD将构建的shRNA-brcaa1质粒与阴性对照质粒shRNA-N转染胃癌MGC-803细胞,24 h后用荧光显微镜观察转染效率,用实时定量PCR检测BRCAA1和GAPDH基因mRNA表达水平;用MTT法检测转染后24 h、48 h与72 h的细胞增殖水平;用Annxin-V PE/7AAD检测转染24 h的细胞凋亡水平;用Western blotting检测转染48 h后的凋亡相关蛋白的表达水平;构建胃癌肿瘤动物模型并进行动物实验。结果: BRCAA1 siRNA表达质粒MGC-803细胞24 h的转染效率为（81.2±2.6） %。转染后48 h MGC-803细胞的BRCAA1 mRNA水平下降了61.4%;MGC-803细胞增殖的抑制率达45.0%;转染siRNA细胞的凋亡率明显高于未转染细胞和对照质粒转染细胞[（14.4±1.6） % VS （5.4±2.0） %,（4.4±2.5） %,P<0.05]。转染siRNA细胞的凋亡相关蛋白Rb与Bax的表达量显著增加（P<0.05）,Bcl-2的表达量显著减少（P<0.05）;注射BRCAA1 siRNA表达质粒7天后,肿瘤生长速度显著下降（P<0.05）。结论:BRCAA1基因的沉默可有效抑制人胃癌MGC-803细胞的增殖和诱导细胞凋亡,其机制与其促进Rb和Bax蛋白表达,抑制Bcl-2蛋白表达有关。同时动物实验表明brcaa1基因可能是一个潜在的针对胃癌的基因治疗靶点。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 brcaa1 基因的研究进展
• 1.2 RNA 干扰
• 1.2.1 RNA 干扰的发现及研究进展
• 1.2.2 RNA 干扰的机制
• 1.2.3 RNA 干扰作用的自我扩增机制
• 1.2.4 RNA 干扰技术的特点
• 1.2.5 RNA 干扰技术的应用
• 1.3 细胞凋亡研究概述
• 1.3.1 细胞凋亡与细胞坏死
• 1.3.2 细胞凋亡的研究进展
• 1.3.3 细胞凋亡的信号途径
• 1.3.4 细胞凋亡的调控
• 1.3.5 细胞凋亡的检测方法
• 1.4 本论文的主要研究工作
• 参考文献
• 2 brcaa1 基因干扰质粒载体的构建
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 设备
• 2.2.2 主要试剂及配方
• 2.3 实验部分
• 2.3.1 shRNA 序列设计
• 2.3.2 shRNA 片段插入shRNA 质粒载体中
• 2.3.3 shRNA 质粒转化
• 2.4 实验结果
• 2.4.1 质粒小抽
• 2.4.2 质粒酶切
• 2.5 实验讨论
• 参考文献
• 3 siRNA 干扰后胃癌MGC-803 细胞中brcaa1 基因表达的分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 仪器设备
• 3.1.2 试剂
• 3.1.3 配方
• 3.2 实验部分
• 3.2.1 shRNA 质粒转染MGC-803 细胞
• 3.2.2 MGC-803 细胞mRNA 的表达
• 3.2.3 MTT 法检测BRCAA1 基因沉默后MGC-803 细胞的增殖情况
• 3.2.4 流式细胞术检测基因沉默后MGC-803 细胞的凋亡情况
• 3.2.5 Western blotting 检测MGC-803 细胞凋亡相关蛋白的表达
• 3.2.6 统计学处理
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 siRNA 表达质粒对胃癌细胞MGC-803 的成功转染
• 3.3.2 转染后MGC-803 细胞BRCAA1 基因mRNA 的表达水平
• 3.3.3 BRCAA1 基因的沉默对人胃癌细胞MGC-803 的增殖速度
• 3.3.4 BRCAA1 基因的沉默对MGC-803 细胞凋亡的影响
• 3.3.5 BRCAA1 基因沉默对MGC-803 细胞凋亡相关蛋白表达的影响
• 3.4 实验讨论
• 参考文献
• 4 siRNA 干扰后动物模型的分析
• 4.1 材料与方法
• 4.2 实验部分
• 4.3 实验结果
• 4.3.1 注射siRNA 质粒后肿瘤模型的变化
• 4.3.2 注射siRNA 质粒后肿瘤模型的数据分析
• 4.4 实验讨论
• 参考文献
• 5 全文总结与展望
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文