农杆菌介导草酸氧化酶（OXO）基因转化向日葵的研究

论文摘要

向日葵籽实含油量高,具有较高的经济价值,是我区重要的经济作物。但向日葵菌核病危害对向日葵生产威胁日益严重,至今未找到菌核病抗源。根据菌核病致病的关键因子—草酸,引入编码草酸降解酶的基因来获得对分泌草酸病原真菌的抗性是一个极具前途的方法。本实验通过研究建立向日葵高效的遗传转化系统,将来自于小麦的草酸氧化酶（Oxalate Oxidase, OXO）基因通过农杆菌介导转化星火花葵,取得以下结果:向日葵茎尖转化再生系统中适宜培养基为:I.分化培养基:MS + 0.5mg/L 6-BA + 0.25 mg/L IAA + 0.1mg/LGA,pH 5.8II.共培养培养基:分化培养基+100μmol/LAS,pH 5.8III.筛选培养基:分化培养基+ 50mg/L Kan + 500mg/L Cef,pH 5.8Ⅳ.生根培养基:1/2 MS + 25mg/L Kan + 300mg/L Cef + 0.5mg/L NAA,pH 5.8用OD600为0.3～0.4左右时的农杆菌侵染茎尖9 min～10min,进行农杆菌介导OXO的遗传转化。通过与农杆菌共培养3d后,经卡那霉素筛选,得到向日葵卡那霉素抗性苗14株,最后经PCR检测阳性为2株,转化率为0.4%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 向日葵组织培养研究进展
• 1.1.1 不同类型的外植体对植株再生影响
• 1.1.2 不同基因型对离体培养影响
• 1.1.3 外植体生理状况对离体培养影响
• 1.1.4 外源激素对向日葵植株再生影响
• 1.1.5 向日葵组织培养存在的问题及解决的对策
• 1.2 向日葵遗传转化研究进展
• 1.2.1 向日葵遗传转化的方法
• 1.2.2 影响向日葵遗传转化的因素
• 1.2.3 向日葵基因工程的现状及前景
• 1.3 向日葵菌核病的研究概况
• 1.3.1 病菌的侵染过程
• 1.3.2 致病的生理生化机制
• 1.3.3 向日葵菌核病的抗性遗传机制
• 1.3.4 向日葵菌核病的抗病育种研究
• 1.4 草酸氧化酶基因（OXO）及其转基因研究概况
• 1.4.1 草酸（OA）的生物合成与分解
• 1.4.2 OXO 的组成、结构及其酶学研究
• 1.4.3 OXO 基因在植物抗毒素基因工程中的应用
• 1.5 本研究的目的和意义
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 根癌农杆菌及其质粒
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 生化试剂
• 2.1.4 溶液的配制
• 2.1.5 仪器
• 2.1.6 培养条件
• 2.2 农杆菌介导向日葵转基因
• 2.2.1 向日葵茎尖遗传转化体系的建立
• 2.2.2 根癌农杆菌介导转化向日葵茎尖
• 2.3 转基因植株的分子检测
• 2.3.1 CTAB 法提取植物总 DNA
• 2.3.2 质粒的提取
• 2.3.3 抗性苗的 PCR 检测
• 3 结果与分析
• 3.1 转化外植体的选择
• 3.2 卡那霉素（Kan）选择压的筛选结果
• 3.3 头孢霉素（Cef）抑菌浓度选择
• 3.4 不同农杆菌感染浓度和感染时间对茎尖转化的影响
• 3.5 乙酰丁香酮的浓度对转化的影响
• 3.6 共培养时间对转化的的影响
• 3.7 生根培养基中激素的选择
• 3.8 Kan 转化子的筛选与植株再生
• 3.9 转基因植株的 PCR 检测
• 4 讨论
• 4.1 影响向日葵遗传转化的因素
• 4.1.1 转化受体类型的影响
• 4.1.2 共培养时间的影响
• 4.1.3 乙酰丁香酮对根癌农杆菌介导向日葵遗传转化的影响
• 4.2 向日葵基因转化受体系统建立中常遇的问题及对策
• 4.2.1 转化率低
• 4.2.2 试管苗玻璃化现象的解决方法
• 4.2.3 试管苗褐化现象的解决方法
• 4.2.4 试管苗的移栽
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 作者简介