猪DGAT基因的克隆、SNP检测及与生产性状的关联分析

论文摘要

在动物遗传育种过程中,随着分子遗传学、数量遗传学和分子生物学技术的发展出现了分子标记辅助选择和渗入等分子育种技术,并得到广泛应用,分子育种技术与常规育种方法相结合极大地加速了猪遗传改良的进程。分子标记辅助选择的基础是寻找与重要经济性状相关的主效基因或分子标记。脂肪组织不仅是动物体的能量储存库,而且还是体内最大的内分泌器官,另外,与脂肪相关的性状是猪胴体和肉质品质的重要经济性状。因此本研究选取2个与脂肪代谢相关的基因——二酰甘油酰基转移酶1和二酰甘油酰基转移酶2作为猪经济性状候选基因进行了研究。获得的研究结果如下:1.利用基因组PCR步移法从猪的基因组中扩增出了二酰甘油酰基转移酶1（diacylglycerol acyltransferase 1,DGAT1）基因5’侧翼2556bp的序列。利用NNPP、MethPrimer、TFSEARCH等生物信息学软件对猪DGAT1基因的核心启动子、转录起始位点、CpG岛的分布以及与启动子相结合的转录因子进行了预测和分析。2.采用5’端缺失策略,结合基因启动子预测结果,以pGL3-Basic Vector为载体构建了16个DGAT1基因启动子区重组质粒。3.应用RT-PCR的方法,克隆了梅山猪和大白猪二酰甘油酰基转移酶2（diacylglycerol acyltransferase 2,DGAT2）基因包括整个编码序列的cDNA片段1481bp（GenBank登录号为EU684958）,ORF为1086bp,编码361个氨基酸;利用DNAStar、CLUSTAL W、Signal P3.0、Prosite等软件对该基因的结构、所编码蛋白质结构和功能等特征进行了预测和分析,并构建了分子系统进化树;克隆了该基因第三、五、六内含子,内含子剪接位点序列均符合GT/AG规则。4.通过组织表达谱分析发现DGAT1基因在各个组织均有表达;通过Real-timeRT-PCR组织表达谱分析,发现DGAT2基因在脂肪、肝脏组织中高表达,其中在脂肪组织表达量最高,在其它组织的表达量很低;选取与三酰甘油代谢关系密切的三个组织——脂肪、肝脏和小肠,比较了梅山猪与大白猪DGAT2基因在这些组织中的表达差异,结果表明梅山猪该基因在这些组织的表达量均显著高于在大白猪上的表达量。5.分析了DGAT1启动子区和DGAT2编码区及内含子的序列在不同猪群中的多态性。结果如下:（1）在DGAT1基因启动子区共发现4处转换突变,其中距翻译起始密码子ATG378bp处—C→T转换引起PvuⅡ酶切位点的改变;（2）在所获得的DGAT2基因的序列中共发现7处突变,颠换突变2个,转换突变5个,其中第七外显子43bp处—G→A转换导致BssNAⅠ酶切位点改变。6.对DGAT1和DGAT2基因共2个多态性位点在不同猪群中进行了基因分型,结果表明这些位点在这些猪群中具有丰富的多态性,并在432头大白×梅山F2代资源家系中与重要生产性状进行了关联分析,结果表明:（1）猪DGAT1 PvuⅡ-RFLP基因型不同时,瘦肉率、胸腰椎间背膘厚、股二头肌PH值、股二头肌大理石纹和肌内脂肪存在显著差异（P＜0.05）,胴体斜长和平均背膘厚存在极显著差异（P＜0.01）。（2）猪DGAT2基因第七外显子BssNAⅠ-RFLP基因型不同时,瘦肉率、6-7胸椎间背膘厚、胸腰椎间背膘厚、股二头肌色值、肌内脂肪和肌内水分存在显著差异（P＜0.05）,肩部最厚处背膘厚、平均背膘厚和背最长肌大理石纹差异极显著（P＜0.01）。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 资源家系测定性状的英文缩写
• 第一章 文献综述
• 1 前言
• 2 比较基因组学研究进展
• 2.1 种间比较基因组学研究
• 2.1.1 全基因组的比较研究
• 2.1.2 系统发生的进化关系分析
• 2.1.3 基因的预测
• 2.1.4 基因组中非编码区域的结构与功能研究
• 2.2 种内比较基因组学研究
• 2.2.1 单核苷酸多态性的发现
• 2.2.2 拷贝数多态性的发现
• 3 单核苷酸多态性研究进展
• 3.1 单核苷酸多态性的概念
• 3.2 单核苷酸多态性在猪遗传育种中的应用
• 3.2.1 标记辅助选择
• 3.2.2 评估遗传多样性
• 3.2.3 种质资源鉴定和管理
• 3.2.4 分子遗传图谱构建和基因定位
• 3.2.5 群体起源及群体亲缘关系分析
• 4 启动子研究进展
• 4.1 真核生物启动子结构
• 4.2 启动子克隆方法
• 4.2.1 T-DNA标签技术
• 4.2.2 基因组文库筛选
• 4.2.3 利用PCR技术克隆启动子
• 4.3 启动子结构与功能的研究策略
• 5 拟研究基因的研究现状
• 5.1 DGAT基因的种类
• 5.2 不同物种DGAT基因的定位及结构
• 5.3 DGAT基因的功能研究
• 5.3.1 与瘦素和胰岛素的关系
• 5.3.2 DGAT基因在脂类代谢中的功能和作用
• 5.4 DGAT基因多态性与生产性状相关性研究
• 5.4.1 DGAT1基因SNPs与生产性状相关性研究
• 5.4.2 DGAT2基因SNPs与生产性状相关性研究
• 第二章 本研究的目的和意义
• 第三章 材料与方法
• 1 试验材料
• 1.1 试验样品和性状测定
• 1.1.1 DNA样品
• 1.1.2 组织样品
• 1.1.3 性状测定
• 1.2 主要仪器和设备
• 1.3 主要药品及试剂
• 1.4 缓冲液和常用试剂的配制
• 2 试验方法
• 2.1 猪基因组DNA的提取
• 2.2 猪基因组DNA的浓度测定和质量检测
• 2.3 总RNA的提取和浓度测定、质量检测及cDNA第一链的合成
• 2.3.1 总RNA的提取
• 2.3.2 总RNA浓度的测定和质量检测
• 2.3.3 cDNA第一链的合成
• 2.4 猪DGAT1基因启动子区的序列分离、鉴定
• 2.4.1 基因组步移库的构建
• 2.4.2 基因组PCR步移
• 2.4.3 步移产物的回收和克隆
• 2.5 猪DGAT1基因启动子区真核表达载体的构建
• 2.5.1 引物设计
• 2.5.2 目的片段的双酶切
• 2.5.3 连接
• 2.5.4 重组质粒的原核表达及鉴定
• 2.5.5 质粒抽提及双酶切鉴定
• 2.6 猪DGAT2基因cDNA序列的克隆、测序及序列分析
• 2.6.1 DGAT2基因cDNA扩增的引物设计
• 2.6.2 利用RT-PCR方法扩增DGAT2基因cDNA片度
• 2.6.3 PCR产物的回收纯化、克隆和测序
• 2.6.4 所获DNA序列的生物信息学分析
• 2.7 猪DGAT2基因基因组序列的克隆、测序
• 2.7.1 引物设计
• 2.7.2 PCR扩增及序列测定
• 2.8 猪DGAT基因的表达分析
• 2.8.1 DGAT1基因RT-PCR组织表达谱分析
• 2.8.2 DGAT2基因荧光定量PCR表达分析
• 2.9 猪DGAT基因的多态性分析
• 2.9.1 引物设计
• 2.9.2 酶切条件
• 2.9.3 基因分型
• 2.9.4 多态标记与生产性状的关联分析方法
• 第四章 结果与分析
• 1 猪基因组DNA以及总RNA的提取与质量检测结果
• 2 猪DGAT1基因启动子的克隆及生物信息学分析
• 2.1 猪DGAT1基因启动子的获得
• 2.2 生物信息学预测DGAT1基因核心启动子区及转录因子结合位点
• 3 猪DGAT1基因启动子区真核表达载体的构建
• 4 猪DGAT2基因cDNA及部分基因组克隆测序及序列分析
• 4.1 猪DGAT2基因编码序列RT-PCR结果
• 4.2 猪DGAT2基因部分基因组PCR结果
• 4.3 猪DGAT2基因序列的生物信息学分析
• 5 猪DGAT基因的表达分析
• 5.1 DGAT1基因的组织表达谱分析
• 5.2 DGAT2基因荧光定量PCR表达分析
• 6 猪DGAT基因的SNP检测及其与生产性状的关联分析
• 6.1 猪DGAT1基因多态性检测及其与生产性状的关联分析
• 6.2 DGAT2基因多态性检测及其与生产性状的关联分析
• 第五章 讨论
• 1 启动子的克隆方法
• 2 DGAT1启动子分析
• 3 关于猪DGAT1启动子区真核表达载体的构建
• 4 利用电子克隆策略分离猪新基因
• 5 关于DGAT基因的表达分析
• 5.1 DGAT1基因RT-PCR组织表达谱分析
• 5.2 DGAT2基因Real-time PCR表达分析
• 6 分子标记的遗传效应分析
• 6.1 DGAT1基因启动子区PvuⅡ-RFLP的遗传效应分析
• 6.2 DGAT2基因第七外显子BssNAⅠ-RFLP的遗传效应分析
• 7 下一步工作
• 小结
• 参考文献
• 致谢