新型生物传感技术用于核酸和蛋白质的检测

论文摘要

蛋白质和核酸是生命体中最重要的两类生物大分子,对人类的遗传疾病和新陈代谢有重要影响,因此建立简单、灵敏、高效的蛋白质、核酸分析方法对临床诊断、药物筛选等医学研究具有重要的意义。针对当前对蛋白质和核酸检测技术提出的高灵敏、高选择、高通量、高特异性和操作简便的要求,本论文建立了一系列新的电化学生物传感方法用于检测蛋白质和核酸,为蛋白质和核酸分子检测提供高性能的技术平台,并通过对实际样品的分析以及与经典检测方法的结果对照,初步验证了这些技术的实用性。（1）本章建立了一种用于目标核酸分子检测的表面邻近杂交电化学传感技术,进一步拓展了表面邻近杂交分析的应用范围。与蛋白分子表面邻近杂交不同的是,核酸分子邻近杂交可利用待测核酸序列本身构成一对邻近探针。为此,我们设计了一个寡核苷酸检测探针,其5’末端修饰二茂铁,3’半片段与目标核酸分子互补且具有较高熔链温度,若目标核酸分子存在,检测探针与其杂交形成稳定的杂交体,杂交体一侧检测探针与目标核酸分子其余序列邻近,促进与电极表面固定的巯基短链寡核苷酸杂交,并使末端标记的二茂铁与电极充分接近,从而产生显著的氧化还原电流。结果表明,该方法的检测线性范围宽,为1 fM到1 nM,而且能够成功地识别不同碱基数错配的序列。与传统夹心式杂交分析相比,该法保证了末端标记的二茂铁与电极充分接近,电子转移效率提高,灵敏度得到了显著改善。而且由于邻近分析使用了更短的互补序列,有效提高了其选择性。（2）基于一对亲合性核酸适体探针同时识别目标分子而空间邻近导致与某一互补序列杂交使稳定性提高这一邻近效应,提出了一种高灵敏的用于检测模型分析物―血小板源性生长因子BB（PDGF-BB）的表面邻近杂交分析电化学适体传感方法。该方法利用该核酸适体探针可成对地与二聚体目标蛋白PDGF-BB同时结合,由于邻近效应促进两尾端序列同时与电极表面固定的两条短链寡核苷酸杂交,使得适体探针末端标记的二茂铁与电极充分接近而发生高效电子传递,从而产生显著的氧化还原电流。该法可实现对PDGF-BB的高特异性地检测,动态响应范围可从1.0 pg/mL到20 ng/mL,检测限可达1.0 pg/mL。（3）构建了一种脂质体滚环扩增免疫传感技术用于超灵敏地检测目标蛋白PSA,通过在脂质体中包埋引物探针和滚环扩增反应两步放大,使得灵敏度大大提高,显示了很好的线性范围和重现性,高选择性,检测范围从0.1 fg/mL到0.1 ng/mL,使检测下限大大降低,达到0.08 fg/mL。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪 论
• 1.1 电化学生物传感器
• 1.1.1 电化学生物传感器的原理
• 1.1.2 电化学生物传感器的分类
• 1.1.3 基底电极的选择
• 1.1.4 检测技术
• 1.2 电化学酶传感器
• 1.3 电化学免疫传感器
• 1.3.1 电流型免疫传感器
• 1.3.2 电位型免疫传感器
• 1.3.3 电容型免疫传感器
• 1.3.4 电导型免疫传感器
• 1.4 电化学DNA 传感器
• 1.4.1 电化学DNA 传感器原理
• 1.4.2 电化学DNA 传感器的种类
• 1.4.3 DNA 探针及其固定方法
• 1.5 电化学生物传感器的发展前景
• 1.6 本研究论文的工作内容
• 第2章 基于邻近分析用于检测核酸分子的电化学DNA 传感器的构建
• 2.1 前言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 仪器
• 2.2.2 试剂
• 2.2.3 核酸探针的设计
• 2.2.4 二茂铁修饰氨基标记的核酸适体探针
• 2.2.5 金电极的处理和核酸适体探针的固定
• 2.2.6 固相表面杂交及目标核酸分子的电化学检测
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 基于邻近表面分析检测目标核酸分子的原理
• 2.3.2 传感器的电化学响应
• 2.3.3 反应温度条件的优化
• 2.3.4 盐离子浓度对反应的影响
• 2.3.5 界面电场对DNA 杂交的影响
• 6^3-/4-溶液中的交流阻抗特性'>2.3.6 传感器在Fe（CN）₆^3-/4-溶液中的交流阻抗特性
• 2.3.7 不同扫速下的二茂铁峰电流
• 2.3.8 电极表面巯基DNA 的固定密度
• 2.3.9 二茂铁标记的核酸适体的表面覆盖率
• 2.3.10 目标DNA 浓度的测定
• 2.3.11 特异性识别碱基错配实验
• 2.3.12 传感器的再生
• 2.4 小结
• 第3章 基于邻近分析用于检测蛋白分子的电化学适体传感器的构建
• 3.1 前言
• 3.2 实验部分
• 3.2.1 仪器
• 3.2.2 试剂
• 3.2.3 核酸适体探针的设计
• 3.2.4 二茂铁修饰氨基标记的核酸适体探针
• 3.2.5 金电极的处理和核酸适体探针的固定
• 3.2.6 固相表面杂交及PDGF-BB 的电化学检测
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 基于邻近表面分析检测PDGF-BB 的原理
• 3.3.2 传感器对目标蛋白的电化学响应
• 3.3.3 反应时间和温度条件的优化
• 3.3.4 反应缓冲溶液中盐离子浓度的优化
• 6^3-/4-溶液中的交流阻抗特性'>3.3.5 传感器在Fe（CN）₆^3-/4-溶液中的交流阻抗特性
• 3.3.6 不同扫速下的二茂铁峰电流
• 3.3.7 电极表面巯基DNA 的固定密度
• 3.3.8 二茂铁标记的核酸适体的表面覆盖率
• 3.3.9 PDGF-BB 浓度的测定
• 3.3.10 干扰实验
• 3.3.11 适体传感器的再生
• 3.4 小结
• 第4章 基于脂质体包埋DNA 和滚环扩增免疫传感技术用于蛋白质的超灵敏检测
• 4.1 前言
• 4.2 实验部分
• 4.2.1 仪器
• 4.2.2 试剂
• 4.2.3 核酸探针的设计
• 4.2.4 脂质体包埋DNA 的制备
• 4.2.5 在包埋了DNA 的脂质体表层标记抗体
• 4.2.6 环形探针模板的合成
• 4.2.7 微孔板中目标蛋白PSA 的捕获
• 4.2.8 滚环扩增放大的免疫测定
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 基于滚环扩增放大用于检测目标蛋白PSA 的原理
• 4.3.2 传感器对目标蛋白的响应
• 4.3.3 包埋了引物探针的脂质体的表征
• 4.3.4 滚环扩增引物的浓度与荧光信号的关系
• 4.3.5 滚环放大的光学表征
• 4.3.6 滚环扩增反应时间的优化
• 4.3.7 包埋引物探针的脂质体的浓度的优化
• 4.3.8 目标蛋白PSA 浓度的测定
• 4.3.9 干扰实验
• 4.3.10 实际样品的检测
• 4.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 附录A 攻读学位期间发表的学术论文目录
• 致谢