尾赤桉再生体系及农杆菌介导的转基因体系研究

论文摘要

本文以尾赤桉无性系DH201-2的叶片和茎段为外植体建立了高效的再生体系,并初步建立了根癌农杆菌介导的遗传转化体系,获得了km抗性植株,研究结果为今后的桉树转基因技术、转基因育种和功能基因组学研究奠定了基础。主要研究结果如下:1.通过对外植体的筛选、激素种类和浓度的调整、培养条件的选择,取自生根培养基上培养30天植株的上部和中部的茎段在mMS+TDZ 0.05mg.L-1+NAA 0.50 mg.L-1的培养基中获得高达57.0%的植株再生;取在生根培养基上培养20天的植株,顶端起第2～4片叶片在mMS+ TDZ0.05 mg.L-1+IBA 0.1 mg.L-1的培养基中获得48.3%的植株再生;适合于茎段和叶片不定芽分化的Ca（NO3）2浓度为0.706 g.L-1。2.尾赤桉无性系DH201-2对卡那霉素具有一定的本底抗性,叶片外植体的卡那霉素抗性达到90mg.L-1;茎段外植体的浓度在120mg.L-1,植株达到更高的水平150mg.L-1。3.当培养基中的头孢霉素达到300mg.L-1时,叶片和茎段仍然保持很高的再生率,且再生植株的形态良好,且能够很好的杀死和清除农杆菌,经过3次每次各15天的培养后极少有农杆菌生长。4.GV3101,EHA105,LBA4404和C58C1四种农杆菌菌株的转化效率比较发现,菌株GV3101对尾赤桉无性系DH201-2的转化效率最高,叶片外植体的gus瞬间表达率达到30%,茎段外植体达到70%。5.经过预培养6天的茎段外植体在农杆菌光密度OD600为0.4～0.5的菌液中浸泡30mins,然后转移到pH值5.6的共培养培养基中共培养4天,达到最高的转化效率;经过预培养3天的叶片,在光密度OD600为0.4～0.5的农杆菌菌液中浸泡30mins,然后转移到pH值5.6的培养基中共培养3天,达到最高的转化效率。6.茎段外植体转化中在农杆菌菌液中和共培养培养基中添加100μM乙酰丁香酮转化效果最好;叶片外植体转化研究中,在共培养培养基中添加100μM乙酰丁香酮转化效果最好。7.茎段具有较高的转化效率,平均转化效率大于50%,最高达到70%;而叶片外植体的转化率偏低,平均转化效率约30%,最高也只有47%。201-2的茎段作为外植体更适于转基因研究。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 引言
• 1.1.1 研究背景
• 1.1.2 研究目的和意义
• 1.1.3 项目来源与经费支持
• 1.2 桉树转基因国内外研究现状与评述
• 1.2.1 桉树再生体系的建立
• 1.2.2 桉树转基因方法
• 1.2.3 转化植株筛选与检测
• 1.2.4 研究评述
• 1.3 研究目标和主要研究内容
• 1.3.1 研究目标
• 1.3.2 主要研究内容
• 1.4 研究技术路线
• 第二章 研究材料与方法
• 2.1 再生研究的材料与方法
• 2.1.1 试验材料
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 试验方法
• 2.2 转化体系研究的材料与方法
• 2.2.1 试验材料
• 2.2.2 试剂
• 2.2.3 试验方法
• 2.3 试验观测与统计分析
• 2.3.1 再生体系研究的试验观测和统计分析
• 2.3.2 遗传转化体系的试验观测与统计分析
• 2.3.3 数据分析和统计模型
• 第三章 结果与分析
• 3.1 再生体系建立的研究
• 3.1.1 激素对再生的影响
• 3.1.2 大量元素的影响
• 3.1.3 外植体生理年龄的影响
• 3.1.4 外植体部位对再生影响
• 3.1.5 增殖与生根
• 3.1.6 小结
• 3.2 遗传转化体系建立的研究
• 3.2.1 Km 筛选浓度的确定
• 3.2.2 Cef 对植株再生影响
• 3.2.3 转化程序的优化
• 3.2.4 筛选培养
• 3.2.5 小结
• 第四章 结论与讨论
• 4.1 结论
• 4.2 讨论
• 4.2.1 再生体系建立
• 4.2.2 转化体系的优化
• 参考文献
• 附录一
• 附录二
• 在读期间的学术研究
• 致谢