花生白藜芦醇合酶cDNA的克隆及其对植物、酵母的遗传转化

论文摘要

白藜芦醇（Resveratrol,简称Res）是一种植物抗毒素,是存在于数十种食物和药物中的一种具有保健功能的成份。Res主要具有抗癌,保护心血管,雌激素调节,抗增殖、诱导细胞凋亡,抗菌等作用。然而,在自然的条件下,Res在植物体内的含量是非常低的,要用传统的提取方法得到高丰度的Res非常困难,并且成本较高。白藜芦醇合酶（Resveratrol synthase,简称RS）是Res合成途径中最后一个起作用的关键酶,也是唯一必须的合成酶,本实验通过分子生物学手段,得到RScDNA,分别对植物和酵母进行遗传转化,已经取得了如下进展: 利用引物悬挂延伸PCR技术从花生总DNA中扩增出带有Kozak序列的RScDNA,然后将其重组到克隆载体中。通过测序证明,所获得的RScDNA基因,与登陆号为AB027606的序列进行比对,同源性达到95%。此序列推测的氨基酸序列与登陆号为p20178的氨基酸比对,同源性达到98%以上。证明应用引物悬挂延伸PCR法已经成功得到了花生RScDNA。 将证明正确的花生RScDNA基因正向插入到植物表达载体PBI121的CaMV35s启动子和NOS终止子之间,成功得到植物表达载体PBI121-L。将所构建的植物表达载体转化农杆菌LBA4404,利用农杆菌介导转入花生下胚轴和胡萝卜下胚轴。 同时,将证明正确的花生RScDNA基因正确连接到pPIC3.5K上,成功构建酵母表达载体pPIC3.5KL。用电激法将重组以后的酵母表达载体pPIC3.5KL导入甲醇型酵母（Pichia. pasteoris）菌株GS115中,获得转化子,对转化子进行组氨酸缺陷筛选和PCR筛选,证明目的基因RScDNA已经成功得整合到了酵母的染色体上。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一部分 文献综述
• 1. 白藜芦醇的研究进展
• 1.1 白藜芦醇的存在
• 1.2 白藜芦醇的药理作用及作用机理
• 2. 白藜芦醇合酶（简称RS）的研究进展
• 2.1 芪合酶的研究进展
• 2.2 白藜芦醇合酶（Resveratrol Synthase，简称RS）的研究进展
• 2.3 白藜芦醇合酶基因的分子生物学研究
• 3. 白藜芦醇合酶基因转基因植物的研究
• 3.1 白藜芦醇合酶基因的转基因技术研究进展
• 3.2 白藜芦醇合酶基因在基因转导过程中的异常表达
• 3.3 花生RS基因的转基因植物研究
• 4. 酵母表达系统的研究进展”
• 4.1 酵母表达系统的优点
• 4.2 影响酵母表达系统表达和应用的因素
• 5. 本研究的目的、意义和内容
• 第二部分 材料和方法
• 1. 主要试剂与仪器
• 1.1 基本试剂及生产厂家
• 1.2 质粒和菌株
• 1.3 主要试剂
• 1.4 主要仪器和厂家
• 1.5 试剂和培养基
• 2. 实验材料
• 3. 实验方法
• 3.1 白藜芦醇合酶cDNA的克隆
• 3.2 克隆载体PBS-TL的构建
• 3.3 植物表达载体PBI121-L的构建
• 3.4 根癌农杆菌的的转化
• 3.5 农杆菌质粒LBA4404-L阳性克隆的的鉴定
• 4. 转基因植物再生体系的建立及遗传转化的初步研究
• 4.1 花生的转化
• 4.2 胡萝卜转化
• 5. 酵母表达系统的建立和鉴定
• 5.1 目的基因的获得
• 5.2 表达载体的构建
• 5.3 酵母表达载体的线性化和纯化
• 5.4 电激转化
• 5.5 酵母重组子的鉴定
• 第三部分 结果与分析
• 1. 白藜芦醇合酶cDNA的克隆和测序
• 1.1 基因组DNA的提取
• 1.2 引物悬挂延伸PCR扩增白藜芦醇合酶cDNA
• 1.3 基因片段的克隆
• 1.4 序列的测定
• 2. 植物表达载体的构建
• 3. 冻融法转化农杆菌LBA4404
• 4. 转基因植物再生体系的初步建立
• 4.1 花生的转化
• 4.2 胡萝卜的转化
• 5. 酵母表达系统的构建和鉴定
• 5.1 酵母表达载体的酶切鉴定
• 5.2 酵母转化子的鉴定
• 第四部分 讨论
• 第五部分 小结
• 第六部分 参考文献
• 致谢