吡格列酮减轻糖尿病大鼠肾脏损伤及其对肾组织Podocalyxin表达的影响

论文摘要

目的：观察糖尿病大鼠尿Podocalyxin（PCX）排泄的动态变化以及不同剂量吡格列酮（Pioglitazone, PIO）对尿PCX排泄及其对肾组织PCX表达的影响，探讨吡格列酮的肾脏保护作用及其可能机制。方法：健康清洁级雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（n=50）禁食12小时后，随机挑选8只作为正常对照组（NC组）给予无菌枸橼酸缓冲液腹腔注射，余下42只大鼠一次性腹腔注射链脲佐菌素（streptozotocin, STZ）65mg/kg。72小时后测尾外周血血糖≥16.7mmol/L并出现多饮多尿等表现者入选为1型糖尿病大鼠模型，随机分为四组：糖尿病模型对照组（DM组，n=8），3个不同剂量PIO干预组（DR1，DR2，DR3组，PIO剂量分别为:10，20，30mg/kg/d，n=8）。造模后第七天记为0周，分别于0，2，4，8周末收集大鼠尿液，测定尿白蛋白（urinary albumin, UAlb），尿沉渣PCX（urinary sediment PCX, UPCX）和尿肌酐（urinary creatinine, UCr）水平。为消除尿量的差异，UAlb和UPCX均通过UCr校正并分别简称尿白蛋白肌酐比（urinaryalbumin/creatinine ratio UACR），尿沉渣PCX肌酐比（urinary sediment PCX/creatinineratio, UPCR）。实验过程中需动态监测大鼠血糖。8周末水合氯醛（300mg/kg）麻醉大鼠，腹主动脉取血检测空腹血糖（fasting blood glucose, FBG）,糖化血红蛋白A1c（glycosylated hemoglobin A1c, HbA1c）,甘油三酯（triglyceride, TG）,总胆固醇（total cholesterol, TC）,高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C）,低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C）,血肌酐（serum creatinine, SCr）,尿素氮（blood urea nitrogen, BUN）。处死大鼠留取左肾并计算肾脏肥大指数（kidney hypertrophy index, KI），光镜和电镜观察肾脏病理变化并计算平均肾小球截面积（mean glomerular cross-sectional area, MGA）,平均体积（meanglomerular volume, MGV），肾小球基底膜厚度（glomerular basement membranethickness, GBMT）和足突融合率（foot process fusion rate, FPFR）。分别应用免疫组化和逆转录聚合酶链反应（reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR）检测肾组织中PCX蛋白及mRNA水平。结果：（1）四组糖尿病大鼠0,2,4,8周末外周血糖及8周末HbA1c均明显高于正常对照组（NC组）（P<0.01），而四组糖尿病大鼠间的差异无统计学意义（P>0.05）。（2）8周末，四组糖尿病大鼠的SCr, BUN, TG, LDL-C均高于NC组，HDL-C低于NC组。各PIO组TG均明显低于DM组（P<0.01, P<0.05），DR2及DR3组HDL-C水平高于DM组（P<0.05）。（3）0周时，五组UACR水平差异无统计学意义；自2周末至8周末，各时间点四组糖尿病大鼠（DM，DR1，DR2和DR3组） UACR均显著高于NC组（均P<0.01）。2周末，四组糖尿病大鼠的UACR差异无统计学意义（P>0.05）；4周末，DR2组和DR3组UACR显著低于DM组（均P<0.01），DR1组UACR虽低于DM组但差异无统计学意义；8周末，DR1，DR2和DR3组UACR均显著低于DM组（均P<0.01），且DR2，DR3组均低于DR1组（P<0.05）。（4） HE染色：NC组肾小球血管袢清晰，肾小球形态和结构未见异常；四组糖尿病大鼠肾小球体积明显增大并伴有球囊腔扩大及系膜基质增生。8周末，四组糖尿病大鼠的肾脏肥大指数（KI）,平均肾小球截面积（MGA）和平均肾小球体积（MGV）均明显高于NC组（P<0.01）。各PIO组的KI和MGA均低于DM组（均P<0.05），且DR2及DR3组均明显低于DR1组（P<0.05）；DR2和DR3组MGV明显低于DM组（P<0.01）。（5）8周末，电镜下NC组肾小球基底膜结构清晰，足突完整，基本无足突融合。与NC组相比，各糖尿病组均可见到肾小球毛细血管基底膜模糊不清，各处有不规则性增厚，可见足突破坏及融合，基底膜厚度（GBMT）及足突融合率（FPFR）均明显高于NC组（P<0.01）,各PIO组其肾小球GBMT，FPFR均高于NC组（P<0.05，P<0.01），但明显低于DM组（P<0.01），且DR2及DR3组低于DR1组（均P<0.01）。（6）0周，五组UPCR水平差异无统计学意义；自2周末至8周末，各时间点四组糖尿病大鼠UPCR均显著高于NC组（均P<0.01）。2，4周末UPCR在四组糖尿病间均无统计学差异。8周末，DR2和DR3组UPCR均明显低于DM组（P<0.01），DR1组UPCR虽较DM组轻度降低但差异无统计学意义（P>0.05）；DR2与DR3组UPCR均显著低于DR1组（P<0.05）。（7）免疫组化结果：8周末，NC组PCX蛋白为棕黄色颗粒状状沿肾小球外周毛细血管袢呈强阳性分布。四组糖尿病大鼠肾小球PCX蛋白表达不均，甚至部分消失。通过Image pro plus软件检测累积吸光度（integrated optical density, IOD）：NC组最高（P<0.01），DM组最低；DR1，DR2及DR3组均明显高于DM组（P<0.05,P<0.01），且DR2及DR3组高于DR1组（P<0.05）。（8）半定量RT-PCR：8周末，各PIO干预组PCX mRNA均较DM组显著升高（P<0.01）但低于NC组（P<0.01），各PIO组间差异无统计学意义。（9）相关分析显示UPCR分别与UACR，肾脏肥大指数（KI）存在显著正相关（r=0.86，r=0.83，P<0.01）。结论：（1）足细胞损伤参与糖尿病肾脏病变的发生,尿PCX排泄增多是反映糖尿病早期肾脏损害的指标之一。（2）吡格列酮可减轻糖尿病大鼠肾脏损伤，该作用可能部分与其增加肾小球PCX蛋白和mRNA表达，抑制PCX随尿排泄有关，这一作用具有一定的剂量依赖性。

论文目录

• 中英文缩写对照表
• 中文摘要
• Abstract
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 2.2.1 糖尿病大鼠模型的制备及分组
• 2.2.2 尿液标本采集
• 2.2.3 尿白蛋白测定
• 2.2.4 尿肌酐测定
• 2.2.5 尿沉渣PCX测定
• 2.2.6 血样采集及组织取材
• 2.2.7 肾脏组织病理形态变化
• 2.2.8 免疫组化法检测肾组织PCX蛋白的表达
• 2.2.9 RT-PCR检测大鼠肾皮质中PCX mRNA的表达
• 2.3 统计学分析
• 3 结果
• 3.1 各组大鼠一般情况
• 3.2 各组大鼠各时间点血糖，8周末HbA1c，SCr，BUN和血脂比较
• 3.3 吡格列酮对糖尿病大鼠肾脏的作用
• 3.3.1 各组大鼠UACR动态变化
• 3.3.2 肾组织HE染色结果
• 3.3.3 各组大鼠肾脏病理指数的比较
• 3.3.4 各组超微电镜结果
• 3.4 吡格列酮对糖尿病大鼠尿PCX排泄及肾组织中PCX表达的影响
• 3.4.1 各组大鼠尿PCX排泄动态变化
• 3.4.2 肾组织PCX蛋白表达
• 3.4.3 肾皮质PCX mRNA表达
• 3.5 UPCR分别与UACR和KI的相关性分析
• 4 讨论
• 4.1 糖尿病肾脏疾病发病机制概述
• 4.2 DN和足细胞损伤
• 4.3 吡格列酮对糖尿病大鼠肾组织的保护作用
• 4.4 吡格列酮对糖尿病大鼠尿PCX排泄及肾组织PCX表达的影响
• 4.4.1 PCX的功能
• 4.4.2 吡格列酮对尿PCX排泄的影响
• 4.4.3 吡格列酮对肾组织PCX蛋白及mRNA表达的影响
• 4.5 吡格列酮保护足细胞的作用机制
• 4.6 实验中的经验和不足
• 5 结论
• 参考文献
• 附录 个人简历
• 致谢
• 综述
• 参考文献