银杏叶多糖抗炎及抑制P-选择素介导白细胞粘附作用研究

论文摘要

炎症（inflammation）是具有血管系统的活体组织对损伤因子所发生的防御反应,它包括致炎因子引起的损伤、机体防御性反应和组织损伤恢复三个方面。适度的炎症反应是机体保护自我的一种免疫过程,而过度的炎症反应会导致机体的免疫损伤甚至危及生命。白细胞是机体的重要炎性细胞,其粘附并穿越血管内皮细胞向炎症部位移行是炎症的重要标志,而白细胞和血管内皮细胞所表达的粘附分子与相应配体的结合是炎症反应产生的重要分子基础。选择素（selectin）是细胞粘附分子的一个家族,主要功能是在炎症发生时介导白细胞与血管内皮细胞,以及白细胞与白细胞或血小板之间的粘附。P-选择素（P-selectin）是表达于活化血小板和血管内皮细胞表面的一种相对分子质量约为140 kDa的跨膜糖蛋白。它在炎症过程的早期甚为重要,而在炎症晚期则要同其他选择素协同发挥作用。P-选择素可通过与相应配体PSGL-1（P-selectin glycoprotein ligand-1）等的相互作用介导白细胞在活化血管内皮细胞上的滚动。因此,发现有效的P-选择素配体类似物,寻找或合成具有影响P-选择素表达及功能的药物,将为炎症发病机理的揭示及治疗提供新的手段。植物多糖是无毒的天然物质,具有较多生物活性。临床研究表明,许多植物,如黄芪、香菇和枸杞等多糖都具有抗急性炎症作用。但由于多糖的结构成分复杂,纯化相对困难,因此影响了它们抗炎作用的深入研究。银杏叶多糖（Polysaccharides of Ginkgo biloba leaf,PGBL）是从银杏叶中提取出来的一种活性成分。研究证明,PGBL具有明显的抗炎活性,但其分子机理还不清楚,许多问题有待于进一步阐述。本研究通过水煮、醇沉、干燥获得了PGBL,经进一步反复冻融、超滤和凝胶层析,截取了含量最多的级分,再经透析、浓缩和干燥获得了纯化的PGBL（p-PGBL）。为搞清PGBL的抗炎作用,我们建立了小鼠急性腹腔炎症模型,通过检测小鼠耳肿胀度及观察小鼠腹腔白细胞和中性粒细胞数,研究了p-PGBL的抗炎效果。为研究PGBL的抗炎机制,我们首先利用流式细胞仪,并通过P-选择素及其阻断性抗体9E1的标记,检测了p-PGBL对P-选择素与其配体相互作用的影响。然后又以筛选出的稳定表达P-选择素的CHO细胞（CHO-P）作为P-选择素的载体,采用体外模拟毛细血管真实生理状态的层流实验,对来自于人早幼粒白血病细胞系（HL-60细胞）和中性粒细胞的滚动和粘附进行检测,观察p-PGBL对它们的影响。为进一步探讨PGBL的抗炎分子机制,我们分离了人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cells, HUVEC）,观察了p-PGBL在流动条件下对中性粒细胞与人脐静脉内皮细胞相互作用的影响。结果表明,p-PGBL为一白色粉末,易溶于水,比旋光度为[a]20D = +43,相对分子量约10 kD,多糖含量98.6 %。进一步分析发现,p-PGBL组成为半乳糖、甘露糖、葡萄糖、阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖醛酸,摩尔比为:6:2.4:1.7:4.6:6.8:1。在抗炎实验中,我们发现p-PGBL能抑制小鼠耳肿胀和腹腔中性粒细胞渗出,与PGBL的抑制效果相比差异不显著,表明p-PGBL较好的保持了原有的抗炎活性。p-PGBL的抗炎作用与肝素相似,都能抑制小鼠腹腔中性粒细胞渗出。流式细胞仪检测结果表明,不同浓度的p-PGBL都对P-选择素与HL-60细胞及中性粒细胞的结合有抑制作用,提示PGBL的抗炎机理主要是充当P-选择素的配体类似物,阻断P-选择素与其配体的相互结合,抑制白细胞的跨血管渗出。模拟毛细血管生理状态的层流实验结果表明,在层壁剪切力为1.0 dyn/cm2的条件下,三种不同浓度的p-PGBL可以明显降低HL-60细胞及中性粒细胞在层流状态下与CHO-P细胞的滚动和粘附,说明在接近生理流动条件下,p-PGBL可通过阻断P-选择素与其天然配体PSGL-1的相互作用,抑制中性粒细胞与活化血管内皮细胞的粘附。这个结果通过HUVEC的层流实验得到进一步证实。另外,我们还发现,P-选择素阻断性抗体（9E1）几乎完全阻断中性粒细胞在CHO-P上的滚动,但仅部分阻断在HUVEC上的滚动,表明在炎症反应过程中,除P-选择素以外其它粘附分子或炎症因子也参与了中性粒细胞的滚动。对于p-PGBL是如何参与阻断其它粘附分子或炎症因子的作用有待进一步研究。我们的实验证明,PGBL有抗炎作用,其主要分子机制是通过有效阻断P-选择素与其配体的相互作用抑制中性粒细胞渗出。本研究不仅为深入阐明PGBL抑制白细胞粘附的抗炎分子机制,促进和发展多糖的抗粘附治疗理论,筛选高效无毒的多糖抗炎药物提供了有价值的实验证据。而且也为银杏资源的开发和利用提供了新的途径。

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英文摘要

前言

一、炎症发生机理与白细胞粘附

（一）炎症发生机理

（二）炎症与白细胞粘附

二、选择素与白细胞的起始粘附

（一）选择素及其结构与功能

（二）选择素的配体

三、中药抗炎及抗白细胞粘附作用

（一）中药的抗炎作用

（二）中药的抗白细胞粘附作用

四、天然多糖的研究和应用

（一）多糖的组成、分布与活性

（二）多糖的作用方式和途径

（三）多糖的研究进展

（四）多糖的研究趋势及存在问题

五、银杏及其多糖的研究进展

（一）银杏的化学成分及其研究进展

（二）银杏多糖的研究进展

六、本论文的研究内容和意义

材料与方法

一、实验材料

（一）细胞系及细胞培养

（二）人嗜中性粒细胞分离

（三）人脐静脉内皮细胞的分离和原代培养

（四）实验动物

（五）药品和试剂

（六）蛋白质、抗体及质粒

二、实验仪器

三、实验方法

（一）银杏叶多糖的提取和纯化

（二） CHO 细胞的稳定转染

（三）小鼠耳肿胀实验

（四）小鼠急性腹膜炎实验

（五）流式细胞仪分析

（六）体外模拟毛细血管的层流实验

（七）免疫荧光标记

（八）统计分析

实验结果

一、银杏叶多糖的提取和纯化

（一）银杏叶粗多糖的提取及分析

（二）银杏叶粗多糖的纯化及纯度鉴定

（三）纯化的银杏叶多糖性质

二、p-PGBL 的抗炎效果及对小鼠急性炎症的抑制

（一） p-PGBL 对小鼠耳肿胀的抑制

（二） p-PGBL 抑制小鼠急性腹膜炎症

三、在静止条件下，p-PGBL 可抑制 P-选择素与白细胞的相互作用

（一） PGBL 和p-PGBL 可抑制 P-选择素与 HL-60 细胞的相互作用

（二） p-PGBL 可抑制 P-选择素与中性粒细胞的相互作用

四、在接近生理状态下，p-PGBL 可抑制白细胞与 CHO-P 的相互作用

（一） CHO 细胞的稳定转染

（二） p-PGBL 可抑制 HL-60 细胞与 CHO-P 的相互作用

（三） p-PGBL 可抑制中性粒细胞与 CHO-P 的相互作用

五、p-PGBL 可抑制中性粒细胞与 HUVEC 的相互作用

（一） HUVEC 的原代培养

（二）在生理状态下，p-PGBL 可抑制中性粒细胞与 HUVEC 的相互作用

讨论

一、PGBL 的纯化 PGBL 是研究其抗炎分子机制的前提

二、p-PGBL 保留了原有的抗炎活性，并且这种活性与 P-选择素相关

三、p-PGBL 可通过干扰 P-选择素与其配体的作用阻断炎症过程

四、PGBL 作为抗炎药物的临床应用前景

结论

本研究主要创新点

参考文献

致谢

作者简历

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