甘蔗蔗糖磷酸合成酶基因及其5’侧翼序列的克隆与鉴定

论文摘要

甘蔗是热带与亚热带地区的重要糖料作物。为增加蔗茎蔗糖含量,研究蔗糖积累过程的主要限速步骤是必要的。蔗糖磷酸合成酶(SucrosePhosphate Synthase,SPS)是蔗糖合成途径的关键限速酶,它对蔗糖积累和碳分配有重要的影响。本研究主要涉及甘蔗SPS基因的克隆及其5’侧翼启动子序列的缺失表达分析。主要研究结果如下:1.克隆分离SPSⅢ基因DNA片段(EU278617,EU278618)和cDNA片段。序列分析表明:此基因含有13个外显子和12个内含子,开放读码框可编码964个氨基酸。2.应用SPSⅢ基因cDNA序列,构建植物表达载体。农杆菌介导转化拟南芥。3.从甘蔗基因组中克隆扩增出先前未知的SPSⅢ基因5’侧翼序列。转录因子结合位点预测分析表明,该序列含有TATA盒以及与光响应和组织特异性表达有关的调节元件。4.将不同长度的SPSⅢ基因5’侧翼序列片段与GUS基因融合,构建嵌合基因。应用微弹法将其轰击甘蔗愈伤组织观测GUS瞬时表达,浸花法转化拟南芥观测GUS在转化植株中的稳定表达,证实了所克隆到的5’侧翼序列具有启动子活性。5.克隆分离SPSⅡ基因cDNA片段(EU269038)。该cDNA片段包含1个3183 bp的开放读码框,可编码1 060个氨基酸。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 研究背景
• 1.2 文献综述
• 1.2.1 植物SPS的主要功能
• 1.2.2 SPS的结构、分布以及家族构成
• 1.2.3 SPS基因的表达
• 1.2.4 SPS基因的遗传转化植物研究
• 1.2.5 甘蔗SPS基因与蛋白的研究进展
• 1.3 本研究的内容与目的
• 第二章 甘蔗SPSⅢ基因克隆及序列分析
• 前言
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 主要试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 甘蔗SPSⅢ基因DNA序列的克隆
• 2.2.2 甘蔗SPSⅢ基因cDNA序列的克隆
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 甘蔗基因组DNA和Total RNA的提取
• 2.3.2 甘蔗SPSⅢ基因DNA序列的克隆
• 2.3.3 甘蔗SPSⅢ基因cDNA序列的克隆
• 2.4 讨论
• 第三章 甘蔗SPSⅢ基因的过表达载体的构建
• 前言
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 植物材料
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 菌种与质粒
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 植物表达载体的构建
• 3.2.2 农杆菌工程菌的制备
• 3.2.3 拟南芥的遗传转化
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 目的SPSⅢ基因的扩增
• 3.3.2 植物表达载体的构建
• 3.3.3 农杆菌转化子的鉴定
• 3.3.5 拟南芥抗性苗的筛选
• 3.4 讨论
• 第四章 甘蔗SPSⅢ基因5′侧翼序列的克隆及分析
• 前言
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 植物材料
• 4.1.2 主要试剂
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 基因组DNA的提取
• 4.2.2 接头连接PCR克隆甘蔗SPSⅢ基因5′侧翼序列
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 甘蔗总DNA的提取
• 4.3.2 接头连接PCR克隆甘蔗SPSⅢ基因5′侧翼序列
• 4.4 讨论
• 第五章 甘蔗SPSⅢ基因5′侧翼序列的缺失表达分析
• 前言
• 5.1 实验材料
• 5.1.1 植物材料
• 5.1.2 主要试剂
• 5.1.3 菌种与质粒
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 不同长度5′侧翼序列片段的扩增
• 5.2.2 5′侧翼序列缺失表达载体的构建
• 5.2.3 对照实验表达载体的构建
• 5.2.4 瞬时表达分析
• 5.2.5 拟南芥的遗传转化
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 5′侧翼序列缺失表达载体的构建
• 5.3.2 对照实验载体的构建
• 5.3.3 瞬时表达分析
• 5.3.4 农杆菌转化子的鉴定
• 5.3.5 抗性苗的筛选及分子检测
• 5.4 讨论
• 第六章 甘蔗SPS Ⅱ基因克隆及序列分析
• 前言
• 6.1 实验材料
• 6.1.1 植物材料
• 6.1.2 主要试剂
• 6.2 实验方法
• 6.2.1 甘蔗叶与茎总RNA的提取
• 6.2.2 甘蔗SPS Ⅱ基因cDNA序列的克隆
• 6.3 结果与分析
• 6.3.1 甘蔗叶与茎Total RNA的提取
• 6.3.2 甘蔗SPS Ⅱ基因cDNA序列的克隆
• 6.4 讨论
• 结论
• 附录1 农杆菌转化子的质粒提取
• 附录2 名词缩写表
• 参考文献
• 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果
• 致谢
• 个人简历