家畜布鲁氏菌病流行病学调查及布鲁氏菌单核苷酸多态性分子分型研究

论文摘要

布鲁氏菌（Beucella）是布鲁氏菌病的致病原,可广泛感染家畜、野生动物和人类。作为一种广泛分布的人兽共患病,布病在全球造成巨大的经济损失和严重的公共卫生问题。自上世纪90年代中后期以来,我国布病疫情出现回升,回升幅度逐年增加,因此全面系统的布鲁氏菌病流行病学调查对摸清畜间疫情现状极为必要。而致病原布鲁氏菌属内种型繁多,各种型间宿主倾向性、生物型性状、毒力强度、临床表现、流行特征等方面各不相同,快速准确的诊断分型技术对流行病学调查溯源和布鲁氏菌病防控计划的制定具有现实意义。目前布鲁氏菌的传统生物分型方法虽作为“金标准”,但费时费力、易受主观意识影响、缺乏准确性、且潜在感染风险；广泛应用的BSCP31-PCR、AMOS-PCR等常规分子生物学方也都存在一定的局限性,因此迫切需要建立一种新型、快速、简便而准确的布鲁氏菌诊断分型方法。本试验利用序列比对筛查特异性单核苷酸多态性位点,建立区分布鲁氏菌属、亚种和生物亚型的实时荧光定量PCR等位基因分子分型方法,并应用于动物布鲁氏菌流行病学调查,与传统生化和PCR方法临床分离株的鉴定和分型结果进行比对,旨在建立一种快速、简单而准确的布鲁氏菌诊断和分型新方法。主要试验和结果如下：1布鲁氏菌实时荧光定量PCR单核苷酸多态性分型方法的建立根据全基因组对比、目前已发表的基因序列辅以管家基因多位点测序所得序列的对比分析,设计合成了14对针对不同等位基因特异性SNP位点的TaqMan MGB探针区分相应的种型,并以布鲁氏菌国际参考菌株、疫苗菌株及阴性对照菌株进行验证。该方法可特异性区分布鲁氏菌属、7个主要亚种,更可区分羊种所有生物亚型（1、2、3型）和牛种部分生物亚型,全程检测时间仅需2h,且检测极限达50fg（相当于15个拷贝基因组）。并对特异性SNP位点所在的目的基因片段进行克隆,构建阳性质控标准品,在定性分析的同时进行快速定量检测。以上结果证明成功建立了针对布鲁氏菌属、亚种和部分亚型的实时荧光定量PCR分子分型方法。2家畜布鲁氏菌病流行病学调查本试验共检测了21个省份的56884份非免疫血清,其中牛血清12989份、羊血清11303份、猪血清27473份、牦牛血清5119份。所有血清均用虎红平板凝集试验（RBPT）和OIE推荐的间接酶联免疫吸附试验（I-ELISA）进行初筛,再用试管凝集试验（SAT）和OIE推荐的竞争酶联免疫吸附试验（C-ELISA）进行复检。结果羊布病个体阳性率高达7.01%,高于牛（6.00%）,并远高于牦牛（3.69%）和猪（0.05%）。调查期间所调查地区总体而言羊布病相对较严重,羊布病个体感染严重,而牛布病感染面较大,其中东北地区的牛布病和华北地区的羊布病相对严重；规模场养殖的牛羊布病感染率高于散养户,且我国存在局部暴发和地方性流行。南方地区猪布病整体处于低发水平；而西部地区牦牛布病阳性率为3.69%,感染率高、感染面大、防控难度大。此外,期间从流产胎儿、乳、全血等临床可疑病料中共分离鉴定到45株布鲁氏菌,其中羊种布鲁氏菌14株、牛种布鲁氏菌20株、猪种布鲁氏菌8株和犬种布鲁氏菌3株,并对部分分离株进行了生物亚型鉴定。对其中20株布鲁氏菌分离株应用实时荧光定量PCR分子分型方法鉴定,与生化方法和常规PCR方法的鉴定结果一致,符合率为100%,可鉴定至亚种和生物亚型,且操作快速、简便而准确,具有推广应用价值。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 第一部分 文献综述
• 第一章 布鲁氏菌病研究进展
• 1 布鲁氏菌病原学
• 2 布鲁氏菌病流行病学
• 2.1 诊断方法
• 2.2 免疫接种
• 2.3 疫情防控
• 第二章 布鲁氏菌分子分型研究进展
• 1 脉冲场凝胶电泳（Pulsed-field gel electrophoresis,PFGE）
• 2 插入序列711（insert sequence 711,IS 711）
• 3 多重PCR（Multiplex Polymerase Chain Reaction,Multiplex PCR）
• 4 限制性酶切片段长度多态性（Restriction Fragment polymorphism,RFLP）
• 5 扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism,AFLP）
• 6 随机扩增多态性（randomly amplified polymorphic DNA,RAPD）
• 7 重复短序列（enterobacterial repetitive intergenic consensus ,ERIC和repetitiveextragenic palindromic,REP）
• 8 rpoB基因多态性
• 9 多位点可变数目串联重复序列（VNTR）分析（Multiple-locus variable-numbertandem repeat analysis,MLVA）
• 9.1 MLVA-8
• 9.2 MLVA-15
• 9.3 MLVA-21
• 10 多位点序列分型（Multilocus sequence typing,MLST）
• 11 单核苷酸多态性位点（Single nucleotide polymorphism,SNP）
• 参考文献
• 第二部分 试验部分
• 第一章 布鲁氏菌实时荧光定量PCR单核苷酸多态性分型方法的建立
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌种
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 基因序列比对
• 1.2.2 单核苷酸多态性位点（SNP）的筛查与确认
• 1.2.3 探针引物的设计合成
• 1.2.4 基因组DNA的提取
• 1.2.5 实时荧光定量PCR分型方法的建立
• 2 结果
• 2.1 基因序列比对结果
• 2.1.1 区分布鲁氏菌属
• 2.1.2 区分布鲁氏菌亚种
• 2.1.3 区分布鲁氏菌生物亚型
• 2.1.4 区分布鲁氏菌疫苗株
• 2.2 单核苷酸多态性位点（SNP）确认结果
• 2.3 实时荧光定量PCR分型方法的建立和初步评价结果
• 2.3.1 实时荧光定量PCR分型方法的体系优化结果
• 2.3.2 实时荧光定量PCR分型方法的特异性试验结果
• 2.3.3 实时荧光定量PCR分型方法的敏感性试验结果
• 2.3.4 实时荧光定量PCR分型方法的重现性试验结果
• 2.3.5 实时荧光定量PCR分型方法阳性质控标准品的制备结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 第二章 家畜布鲁氏菌流行病学调查
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 样品采集
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 血清学检测流程
• 1.2.2 分离菌株的鉴定和分型
• 1.2.3 分离株的基因扩增测序及系统进化分析
• 2 结果
• 2.1 家畜布鲁氏菌病流行病学调查结果
• 2.1.1 三间分布
• 2.1.2 重点地区牛羊布病抽样调查结果
• 2.2 病原分离鉴定结果
• 2.2.1 生化鉴定结果
• 2.2.2 常规PCR鉴定结果
• 2.3 部分临床分离株实时荧光定量PCR方法鉴定和分型结果
• 2.3.1 布鲁氏菌属水平的鉴定结果
• 2.3.2 布鲁氏菌亚种水平的鉴定结果
• 2.3.3 布鲁氏菌生物亚型水平的鉴定结果
• 2.4 临床分离株基因扩增测序和系统进化分析结果
• 2.4.1 omp25基因扩增结果
• 2.4.2 系统进化分析结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 全文总结
• 附录
• 致谢