EGCG对红细胞膜的促氧化作用研究

论文摘要

茶多酚是茶叶中主要的功能性成分,包括黄烷醇（又称儿茶素类）、黄酮醇、酚酸和缩酚酸类以及其它多酚类化合物。儿茶素包括表儿茶酚（Epicatechin, EC）、表儿茶酚-3-五倍子酸酯（Epicatechin-3-gallate, ECG）、表没食子儿茶素（Epigallocatechin, EGC）和表没食子儿茶酚-3-五倍子酸酯（Epigallocatechin-3-gallate, EGCG）。其中,EGCG是含量最丰富且最具生物活性的儿茶素之一。这些具有多酚结构的物质由于其抗氧化活性,被证实对人体具有多方面的有益作用。另一方面,越来越多的证据显示,EGCG在生物体系中有潜在的促氧化作用,包括修饰蛋白质、破坏DNA链和诱导活性氧组分（Reactive oxygen species, ROS）的生成。本文利用人红细胞作为实验材料,研究了EGCG对红细胞膜的促氧化作用。运用SDS-PAGE和NBT-染色分析探究EGCG作用于红细胞膜后生成的儿茶酚-蛋白络合物。主要实验方法和试验结果一、EGCG与红细胞膜的相互作用1 EGCG诱导红细胞膜蛋白聚集EGCG诱导红细胞膜蛋白聚集的效应与其浓度有关。不同浓度的EGCG与红细胞膜孵育一段时间后,可导致高分子量聚合物生成,高分子量聚合物的含量与EGCG的浓度呈正相关。进一步研究其余三种儿茶素（EC, ECG和EGC）对红细胞膜的影响,发现只有EGC在选定的试验体系中具有与EGCG相同的促氧化效应。据此推断,B-环上的三羟基结构是儿茶酚诱导红细胞膜蛋白聚集的必要条件。2金属离子对EGCG促氧化作用的影响EGCG很容氧化或自氧化,在B-环或D-环上形成醌类结构,在这个过程中会形成半醌自由基和活性氧组分（ROS）。金属离子,如Fe2+,Fe3+和Cu2+,在EGCG氧化产生自由基过程中起催化作用。本文研究发现,EDTA能够部分抑制EGCG诱导红细胞膜蛋白聚集,说明金属离子在EGCG诱导红细胞膜蛋白聚集过程中具有重要作用。但具体是哪种金属离子还没有得到确认。3 EGCG通过与蛋白巯基结合诱导细胞膜蛋白聚集为了探究EGCG诱导红细胞膜蛋白聚集的分子机制,在EGCG和红细胞膜反应体系中分别加入巯基封闭试剂和巯基化合物,SDS-PAGE结果显示,巯基封闭剂NEM （N-ethylmaleimide）和巯基试剂DTT （Dithiothreitol）.半胱氨酸（Cys）和GSH （Glutathione）都可不同程度抑制EGCG诱导红细胞膜蛋白聚集。由此证实,蛋白巯基参与了蛋白质分子间的交联。为了进一步验证巯基在EGCG诱导红细胞膜聚集过程中的作用,采用Ellman’s方法测定红细胞膜巯基含量。结果发现,巯基含量随着EGCG浓度的增加而降低。4NBT-染色分析EGCG对红细胞膜的作用采用SDS-PAGE和NBT染色分析研究显示,膜蛋白在与EGCG作用后,可形成含有醌式结构的蛋白。巯基封闭剂NEM和巯基还原剂DTT可以完全抑制EGCG诱导红细胞膜蛋白形成醌类蛋白；而自由基清除剂抗坏血酸可以部分抑制醌类蛋白的形成。凝胶泳道上高分子量区域的染色比较重,说明骨架蛋白如肌动蛋白和血影蛋白比其它蛋白能够结合更多的醌组分,这是由于这些蛋白分子具有更多的自由巯基。5 EGCG诱导红细胞膜蛋白形成高分子量聚合物的可逆性有大量证据显示,蛋白巯基与醌或醌类化合物之间的共价键合是可逆的。为了探究EGCG诱导红细胞膜蛋白生成高分子量聚合物的可逆性,通过SDS-PAGE观察NEM和巯基试剂（DTT, Cys和GSH）对已形成的醌类蛋白的影响。结果发现,反应顺序变换后,EGCG诱导红细胞膜蛋白聚集形成高分子量聚合物受到部分抑制。说明EGCG与红细胞膜蛋白分子间的共价结合是部分可逆的。二、EGCG对红细胞的影响1 EGCG对红细胞中高铁血红蛋白（MetHb）含量的影响本实验以人体血样作为材料,研究EGCG对人的离体红细胞血红蛋白组成的影响。实验结果显示,50μM EGCG作用于红细胞时,红细胞中高铁血红蛋白与对照比较有所增加；当浓度增大到100μM时,其作用达到饱和。EGCG和NaNO2共同作用于红细胞时,高铁血红蛋白含量也会随着EGCG浓度的增加而增加。2 EGCG对红细胞中GSH含量的影响GSH在维持红细胞的正常结构和功能方面具有重要的作用,GSH含量的多少能够间接反映红细胞氧化胁迫的情况,同时,也可以反映红细胞的抗过氧化能力。EGCG和叔丁基过氧化物分别作用于红细胞,红细胞内GSH含量无明显变化。3 EGCG对红细胞渗透脆性的影响在本实验中,将EGCG和叔丁基过氧化物处理过的红细胞加入不同浓度的NaCl溶液中,测定红细胞的渗透脆性。结果显示,EGCG处理过的红细胞的渗透脆性曲线与对照相比无明显变化；加入叔丁基过氧化物后红细胞渗透脆性增大；同时加入EGCG和叔丁基过氧化物,红细胞的渗透脆性比单独加入叔丁基过氧化物有所降低。这说明,EGCG在外加胁迫条件下有时会表现出一定的抗氧化性质。结论EGCG能够共价键合到红细胞膜蛋白巯基上,导致蛋白质分子间交联形成高分子量聚合物。我们推测,EGCG氧化形成儿茶酚-醌中间体,该中间体作为交联剂,红细胞膜蛋白肽链通过巯基-S-烷基化结合到其B环的C2-和C6-位点上。EGC也能够诱导红细胞膜蛋白聚集,EC和ECG无此效应。据此推测出,B环的三羟基结构是儿茶酚诱导膜蛋白聚集的必要条件。金属离子络合剂EDTA和自由基清除剂抗坏血酸通过阻断儿茶酚-醌的形成,抑制EGCG诱导的红细胞膜蛋白聚集。此外,EGCG在外加胁迫条件下有时会表现出一定的抗氧化能力。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 文献综述
• 1.1 引言
• 1.2 茶多酚的生物效应
• 1.2.1 茶多酚的抗氧化性质
• 1.2.2 微量金属催化多酚类化合物氧化
• 1.2.3 茶多酚的促氧化性质
• 1.3 红细胞简介
• 1.3.1 红细胞的结构和功能
• 1.3.2 红细胞膜的组成
• 1.3.3 膜组分的不对称分布
• 1.3.4 红细胞膜的流动性
• 1.3.5 红细胞的变形性
• 1.3.6 红细胞的抗氧化体系
• 1.4 自由基对红细胞的影响
• 1.4.1 自由基的类型
• 1.4.2 自由基对红细胞膜的损伤
• 1.4.3 抗氧化剂对自由基的作用
• 1.5 小结
• 第2章 实验材料及方法
• 2.1 材料与试剂
• 2.1.1 材料及药品
• 2.1.2 溶液及配制
• 2.2 实验仪器
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 红细胞的分离
• 2.3.2 红细胞膜的制备
• 2.3.3 红细胞膜中自由巯基的定量分析
• 2.3.4 SDS-PAGE分离红细胞膜蛋白及NBT染色分析
• 2.3.5 红细胞膜渗透脆性曲线的测定
• 2.3.6 红细胞内谷胱甘肽（GSH）含量的测定
• 2.3.7 红细胞中高铁血红蛋白（MetHb）含量的测定
• 2.4 统计学处理
• 第3章 结果
• 3.1 EGCG诱导红细胞膜蛋白聚集
• 3.2 蛋白巯基在EGCG和EGC诱导红细胞膜蛋白生成高分量聚合物中的作用
• 3.3 金属离子和抗氧化剂对EGCG促氧化作用的影响
• 3.4 NBT-染色观察醌蛋白
• 3.5 EGCG诱导红细胞膜蛋白形成高分子量的聚合物的可逆性
• 3.6 EGCG对红细胞膜蛋白巯基含量的影响
• 3.7 高铁血红蛋白在完整红细胞中的形成
• 3.8 EGCG对红细胞中GSH含量的影响
• 3.9 红细胞膜渗透脆性曲线测定
• 第4章 讨论
• 4.1 EGCG诱导红细胞膜蛋白聚集的分子机制
• 4.2 EGCG与完整红细胞的相互作用
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间的研究成果