Rhodanobacter sp.GS3054菌酶转化法制备人参皂苷Rd的研究

论文摘要

我国是人参的故乡,人参是我国的传统名贵中药,人参以其卓越的对多种疾病的防治效果和对人体的滋补强壮作用,已久为世界上驰名中药。人参中的天然活性成分具有很高的药用价值,人参的主要生物活性成分为人参皂苷,其中人参皂苷Rd,具有促进副肾皮质荷尔蒙分泌作用和保护肾的作用,能促进T细胞增殖,提高天然杀伤细胞（NK）的活性。本论文以制备人参皂苷Rd及其酶的分离提取为主要目的。本论文主要以细菌产酶,利用酶转化法制备人参皂苷Rd。筛选了产酶的最适菌种,研究了产酶条件的优化、酶反应产物人参皂苷Rd的分离提纯和酶的分离提纯及其酶的性质。本实验采用sp.GS3054作为产酶菌种,最适诱导物为槐花,最适培养时间为3天,最适培养温度为30℃,最适培养基为2号培养基。利用DEAE-Cellulose离子交换柱对人参皂苷酶分离提纯,提纯酶液进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳来检测其纯度,得到一条单带,分子量为62kDa。确定最适酶反应条件,三种底物浓度均为为0.1%,反应最适PH值为5.0,最适酶反应温度为30℃,研究了一些无机离子对酶反应的影响,其中钠离子、钾离子对酶反应的影响不大;铁离子对酶反应的影响较大,反应生成Rd以后继续反应生成其它人参皂苷;镁离子和钙离子对酶反应由一定的促进作用;铝离子和铜离子,当离子浓度较低时,对酶反应具有促进作用,当离子浓度较高时,它又抑制酶反应的进行。从西洋参须中提取总皂苷,在分离人参二醇类皂苷,其得率为6%;对西洋参人参二醇类皂苷样品30g进行了硅胶柱分离,得到含人参皂苷Rd皂苷9.46g,得率为32.5%,得到纯Rd4.70g,得率为15.6%;较纯Rc2.46g,得率8.2%;较纯Rb14.84g,得率为16.1%。采用结晶的方法对1g样品（硅胶柱分离后的较纯人参皂苷Rd）进行提纯,得到人参皂苷Rd 500mg,得率为50%,其纯度为98%左右。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 人参概述
• 1.1.1 人参的使用历史
• 1.1.2 人参的性状及生长环境
• 1.1.3 人参的分类
• 1.2 人参的化学成份和结构
• 1.2.1 人参皂苷的化学成分
• 1.2.2 人参皂苷的结构和命名
• 1.3 人参皂苷的理化性质及药理作用
• 1.3.1 人参皂苷的理化性质
• 1.3.1.1 皂苷的水解性
• 1.3.1.2 人参皂苷的泡沫及溶血
• 1.3.1.3 人参皂苷的稳定性
• 1.3.1.4 皂苷的显色反应
• 1.3.2 人参皂苷的药理作用
• 1.4 人参皂苷的提取与分离
• 1.4.1 人参皂苷的提取
• 1.4.1.1 有机溶剂提取法
• 1.4.1.2 超声波提取法
• 1.4.1.3 超临界流体提取法
• 1.4.2 人参皂苷的分析鉴定
• 1.4.2.1 薄层层析
• 1.4.2.2 高效液相色谱
• 1.4.2.3 核磁共振
• 1.4.2.4 高效液相色谱一质谱联用
• 1.4.2.5 酶联免疫
• 1.5 人参皂苷酶蛋白的分离提纯
• 1.5.1 酶蛋白的制备
• 1.5.2 酶蛋白的纯度分析
• 1.6 人参皂苷转化方面的研究进展
• 1.6.1 酸水解法
• 1.6.2 生物转化法
• 1.7 人参制品的发展趋势
• 1.8 本论文研究的目的及意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 菌种的筛选
• 2.2.2 产酶最适条件的确定
• 2.2.2.1 最适培养基的确定
• 2.2.2.2 最适诱导物的确定
• 2.2.2.3 最适产酶温度的确定
• 2.2.2.4 薄层层析法（TLC）
• 2.2.3 人参皂苷糖苷酶的分离纯化
• 2.2.3.1 DEAE阴离子交换树脂
• 2.2.3.2 人参皂苷糖苷酶纯度的测定
• 2.2.4 最适酶反应条件的确定（或酶的性质）
• 2.2.4.1 最适底物浓度的确定
• 2.2.4.2 最适PH值的确定
• 2.2.4.3 最适反应温度的确定
• 2.2.4.4 离子对酶反应的影响
• 2.2.5 大量反应实验制备人参皂苷Rd粗品
• 2.2.5.1 人参皂苷的提取
• 2.2.5.2 制备人参皂苷Rd粗品
• 2.2.6 产物的分离
• 2.2.6.1 AB-8大孔树脂吸附
• 2.2.6.2 常压硅胶柱分离人参皂苷Rd
• 2.2.6.3 高压硅胶柱分离人参皂苷
• 2.2.6.4 高效液相色谱检测
• 第三章 结果与讨论
• 3.1 菌种的筛选
• 3.2 产酶最适条件的确定
• 3.2.1 最适诱导物与培养基的确定
• 3.2.1.1 诱导物浓度的确定
• 3.2.1.2 最适培养基和最适诱导物的确定
• 3.2.2 最适产酶温度（培养温度）的确定
• 3.2.3 最适产酶时间（培养时间）的确定
• 3.3 人参皂苷酶分离及纯度检测
• 3.3.1 酶蛋白的分离提纯
• 3.3.2 提纯后人参皂苷酶活力的检测
• 3.3.3 人参皂苷酶纯度
• 3.3.3.1 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测提纯酶的纯度
• 3.3.3.2 人参皂苷酶分子量的测定
• 3.3.3.3 纯酶的反应
• 3.4 人参皂苷酶的性质
• 3.4.1 最适底物浓度的确定
• 3.4.2 最适pH值的确定
• 3.4.3 最适反应温度的确定
• 3.4.4 离子对酶反应的影响
• 3.5 人参皂苷Rd的分离提取
• 3.5.1 人参二醇类皂苷的提取
• 3.5.2 硅胶柱分离人参皂苷Rd
• 3.5.3 人参皂苷单体的提纯及检测
• 3.5.3.1 人参皂苷单体的精制
• 3.5.3.2 人参皂苷单体纯度的检测
• 第四章 结论
• 参考文献
• 致谢