结直肠腺瘤—正常黏膜抑制性差减杂交文库的系统性分析及差异表达基因的研究

论文摘要

结直肠癌是一种常见的消化系统恶性肿瘤,在欧美发达国家,其发病率、死亡率数十年来并没随着医疗技术及癌症研究的发展而明显改善。2007年,美国结直肠癌的发病率和死亡率在男、女性中仍居恶性肿瘤的第三位。在我国,结直肠癌发病率总体呈上升趋势并已位居恶性肿瘤的第三位。随着人们膳食结构和生活方式的西方化,近二十年我国也将进入结直肠癌发病的高峰期。结直肠癌的发生发展是个多步骤多阶段、多基因参与的过程,其中正常黏膜-腺瘤-腺癌途径是最重要的发生模式。结直肠腺瘤,作为结直肠癌的癌前病变,对于它的研究,将有助于了解结直肠癌发生的早期分子事件,对结直肠癌早期诊断和治疗意义重大。要揭示结直肠腺瘤发生演进的机制,首先就应了解正常肠黏膜和腺瘤之间复杂的分子差异。我们实验室于1999年应用抑制性差减杂交法（suppressivesubtraction hybridization,SSH）利用一个同时患有结直肠腺瘤和腺癌的病例构建了三个cDNA差减文库,即腺瘤相对于正常黏膜的差异片段文库（A-N）,腺癌相对于正常黏膜的差异片段文库（T-N）和腺癌相对于腺瘤的差异片段文库（T-A）。前期的Northern blot和反向Northern验证,已帮助我们发现了一些有意义的基因。因此,我们对A-N文库全部109个差异表达的cDNA克隆进行了测序,利用自行搭建的核酸序列分析平台及在线Webgestalt分析工具对这些差异表达候选基因进行了总体分析。随后对一些感兴趣的基因进行了验证,并对2个基因进行了深入细致的研究。借此,以揭示结直肠腺瘤的整体分子特征,寻找用于早期诊断、治疗及预后的分子标志物。首先,为了能高效准确自动化地获得这109个差异表达cDNA克隆所代表的基因,我们建立了从EST测序峰图文件到候选基因的核酸序列自动化分析平台。该平台由自行整合的核酸序列分析程序包（软件登记号:2005RS01351）和自行编写的GetUni软件包（软件登记号:2005SR10081）两个能独立执行功能的软件组成。利用该分析平台,及下载到本地计算机的核酸非冗余数据库和人类UniGene数据库,我们最终获得62个差异表达候选基因。这62个基因的基本信息（如基因序列号,基因名称、基因代码、染色体定位等）及出现次数被自动以Excel格式输出并保存于本地计算机。随后,为从整体上分析这些基因的分布特征,获得基因的分子功能,涉及的信号通路等信息,我们利用Gene Ontology网站进行了WebGestalt分析（WEB-based GEne SeT AnaLysis Toolkit,http://bioinfo.vailderbilt.edu/gotm/）。在线分析显示,按照生物学过程分类（Level 4）,62个候选基因在细胞代谢（cellularmetabolism）、大分子代谢（macromollieulr metabolism）、初级代谢（primary metabolism）等3个层面的分布最为集中,其中包括6个核糖体蛋白基因家族成员。分子功能分类（Level 4）则以嘌呤核苷酸结合（purine nucleotide binding）相关基因居多。KEGG信号通路分析,发现候选基因中共有50个基因参与38条信号通路,其中有6个基因与核糖体通路相关,2个基因参与MAPK通路。Biocarta信号通路分析,共有29个基因参与25条信号通路,各有2个基因参与IL5信号通路（IL5 Signaling Pathway）、抗原处理和提呈（Antigen Processing and Presentation）和过敏反应中化学因子网络中嗜酸性粒细胞作用（The Role of Eosinophils in the Chemokine Network of Allergy）等3条免疫相关信号传导通路。为了验证A-N文库筛选的结果,我们对文库中代表性基因的mRNA表达水平进行了检测。我们选择了文库中出现次数相对较多的REG4、PERP、YWHAZ及KLF4基因,采用SYBR Green荧光定量PCR方法在8例结直肠正常黏膜-腺瘤-腺癌（N-A-T）配对组织,49例结直肠正常黏膜-腺癌（N-T）配对组织中检测其mRNA的表达水平。结果显示在受检的8例N-A-T配对、49例N-T配对样本中,REG4在7例腺瘤,23例腺癌中的表达高于配对正常黏膜（中位表达倍数分别为2.263、0.982）,并在6例N-A-T配对组织腺瘤中的表达高于正常黏膜及腺癌。其在腺瘤中的表达显著高于配对正常黏膜（p=0.036）。PERP在6例腺瘤,39例腺癌中的表达高于正常黏膜（中位表达倍数分别为2.146、1.941）,并在5例N-A-T配对组织的腺瘤中的表达高于正常黏膜及腺癌。PERP在腺瘤及腺癌中的表达均显著高于配对正常黏膜（p=0.036,p=0.000）。YWHAz在5例腺瘤,31例腺癌中的表达高于正常黏膜（中位表达倍数分别为1.339、1.200）,其在4例N-A-T配对组织的腺瘤中的表达高于正常黏膜及腺癌,其在腺癌中的表达显著高于配对正常黏膜（p=0.03）。KLF4仅在2例腺瘤,4例腺癌中高表达（中位表达倍数分别为0.521、0.230）,而其在腺癌中表达显著低于配对正常黏膜（p=0.000）。至此,A-N文库筛选出的在结直肠腺瘤中高表达的基因得到了较好的验证。加上前期已验证的6个核糖体蛋白基因及C60rf37基因,体现了SSH方法的可靠性。鉴于PERP是新近发现在肿瘤转移细胞系中低表达的新基因,可能是p53下游的效应分子。因此,我们对在结直肠腺瘤及腺癌中均显著高表达的PERP基因进行了表达及功能的深入研究。首先,利用组织芯片（TMA）结合RNA原位杂交（ISH）和免疫组化（IHC）技术,分别从mRNA及蛋白水平检测了PERP在结直肠组织中的表达情况。结果显示,PERP mRNA在结直肠正常黏膜的隐窝下部表达较上部高,其在结直肠正常粘膜、腺瘤及腺癌组织中表达率分别为62.5%,97.6%,88.9%。PERP在结直肠腺瘤、腺癌组的表达显著高于正常粘膜组（p=0.000,p=0.000）,腺瘤与腺癌组无显著差异（p=0.249）,其在腺瘤及腺癌中的表达显著高于配对正常黏膜（p=0.046,p=0.000）。PERP蛋白在正常结直肠黏膜、腺瘤及腺癌组织中表达率分别为67.7%,84.2%,81.5%。腺瘤与腺癌组的表达显著高于正常黏膜组（p=0.001,p=0.001）,腺瘤组与腺癌组间无显著差异（p=0.564）。PERP蛋白在腺癌中的表达显著高于其配对正常黏膜（p=0.000）。为了探究PERP表达与p53蛋白表达的关系,我们对同批组织芯片进行了p53蛋白的检测。统计结果显示,p53蛋白在正常结直肠黏膜、腺瘤及腺癌组织中表达率分别为3.17%,78.10%,71.90%。腺瘤组及腺癌组中的表达显著高于正常黏膜组（p=0.000,p=0.000）,腺瘤与腺癌组间差异不显著（p=0.170）。其在腺癌中的表达显著高于配对正常黏膜（p=0.000）。随后,我们进行的相关性分析发现,PERP mRNA及蛋白水平与p53蛋白水平均成正相关,相关系数分别为r=0.452（p=0.000）;r=0.341（p=0.000）。为探讨PERP在结直肠肿瘤中的可能作用,我们构建含有PERP全长编码区的真核表达型质粒PcDNA3.1-PERP CDs,对不表达或低表达内源性PERP基因的结直肠癌LoVo和RKO细胞株进行了基因转染,并检测了转染PERP后的生物学效应。通过G418药物筛选,我们得到稳定表达外源性PERP的LoVo-CDs和RKO-CDs细胞株。MTT细胞增殖能力检测结果显示:转染PERP能促进LoVo和RKO细胞株的生长（p=0.000,p=0.058）。PI单染,PI/Annexin V双染的流式细胞术检测发现:转染PERP对LoVo和RKO细胞株的凋亡和周期无明显影响。检测细胞迁移能力的划痕实验显示转染PERP基因,增强了LoVo细胞株的迁移能力。但是,由于构建A-N文库时使用的是来源于一个病例的样本,造成了筛选结果的偏倚。如我们发现KLF4基因Q-PCR的验证结果与文库筛选结果相反。但是,新近不少研究发现KLF基因家族与细胞的分化成熟有关,已成为癌症研究中的热点。肠道由于其黏膜隐窝的增殖-分化动力学,成为研究细胞分化成熟的良好模型。我们Q-PCR的结果显示KLF4在正常黏膜-腺瘤-腺癌中的表达依次降低,该现象不仅提示了KLF4基因的表达与细胞分化成熟相关,更支持了长期存在的“肿瘤是细胞分化紊乱或逆向分化”的理论,引起我们极大兴趣。因此,我们对KLF4在结直肠中的表达情况进行了比较全面的临床病理研究。首先,我们利用免疫组织化学方法检测了KLF4蛋白在结直肠组织中的表达及分布情况。由于KLF4可能与细胞分化成熟相关,在分析免疫组化结果时,我们将结直肠黏膜隐窝分成上1/2和下1/2进行精细定量分析。我们发现,所有的（73/73）的结直肠正常黏膜均表达KLF4,KLF4+细胞主要位于隐窝上部。隐窝上1/2阳性细胞数（35.7%±19.0%）显著高于隐窝下1/2（11.4%±9.8%）（p＜0.01）。在结直肠腺瘤,虽然KLF4+细胞数显著低于正常黏膜,但其分布模式与正常黏膜相似,异形增生的隐窝上1/2阳性细胞数（19.7%±20.5%）显著高于下1/2（9.0%±13.4%）（p＜0.01）。腺瘤KLF4+细胞（15.0%±16.3%）显著低于瘤旁残留黏膜（30.6%±13.5%）。而腺癌中,KLF4弥散表达,总体阳性率仅3.0%±6.72%,显著低于配对癌旁残留黏膜（2.0%±4.6%vs23.4%±11.5%）（p＜0.01）。从整体来看,KLF4蛋白在正常黏膜（23.5%±13.0%）、腺瘤（15.0%±16.3%）、腺癌（3.0%±6.72%）中的表达依次降低,且差异均显著（p＜0.01）。结直肠正常黏膜、腺瘤、腺癌KLF4阳性率分别为100%（73/73）,58.3%（28/48）、38/129（29.5%）。腺瘤与腺癌的阳性率显著低于正常黏膜（p＜0.001）。低级别腺瘤中KLF4阳性率（26/39）显著高于高级别腺瘤（2/9）（p＜0.01）。在大于60岁或肿瘤芽较多（≥15）的结直肠癌病例中表达显著下降（p＜0.01,p＜0.01）。KLF4表达阳性病例总体生存率（76.3%,29/38）高于KLF4阴性病例（68.1%,62/91）,阳性病例5年生存率（67.9%,19/28）高于阴性病例（51.7%,30/58）（p=0.172）,阳性病例的5年累积生存率高于阴性病例（74%vs 63%,p=0.379）。在发生淋巴结转移的病例中,KLF4表达阳性的预后相对阴性的病例较好（p=0.252）。为了探讨KLF4在结直肠肿瘤中低表达的原因及其与细胞分化之间的关系,我们利用去甲基化药物5-aza-dC和促分化药物丁酸钠处理结直肠癌细胞株SW480、SW620和RKO。Q-PCR检测处理前后KLF4 mRNA的表达变化。结果显示:5-aza-dC处理SW480、SW620及RKO后,KLF4的表达分别升高1.14、5.49及2.10倍。丁酸钠处理后,KLF4在SW480、SW620及RKO细胞系中的表达分别升高1.39、1.57及1.47倍。其中5-aza-dC处理显著上调了SW620细胞株KLF4基因的表达（p＜0.01）。通过上述研究,我们得出以下结论:（1）我们成功建立了从EST测序峰图到候选基因的核酸序列自动化分析平台。利用该平台结合在线WebGestalt分析,有助于从整体水平揭示结直肠腺瘤的分子特征,发现结直肠肿瘤发生发展的早期分子事件,寻找用于早期诊断、治疗及预后的分子标志物。（2）PERP基因在结直肠肿瘤中高表达,其在结直肠癌中的高表达可能与p53基因的突变有关。PERP能促进结直肠癌LoVo,RKO细胞株的增殖和迁移能力。（3）KLF4基因与结直肠黏膜终末分化相关。其在结直肠肿瘤中的低表达可能与其基因高甲基化状态有关。KLF4低表达是结直肠癌淋巴结转移病人预后不良的潜在指标。（4）抑制性差减杂交（SSH）仍不失为一种寻找差异表达基因的方法,但是进行数据分析时要谨慎。利用SSH构建差异表达基因文库有助于我们阐述疾病发生的分子机制,寻找用于早期诊断、治疗及预后的分子标志物。

论文目录

• 一、缩略语
• 二、中文摘要
• 三、英文摘要
• 四、正文
• （一）前言
• （二）主要的仪器设备和试剂
• （三）第一部分:结直肠腺瘤抑制性差减杂交文库生物信息学分析
• 1.材料与方法
• 2.结果
• 3.讨论
• （四）第二部分:PERP基因在结肠肿瘤中的高表达及其功能学初探
• 1.材料与方法
• 2.结果
• 3.讨论
• （五）第三部分:KLF4基因在结直肠肿瘤中的低表达及其意义
• 1.材料与方法
• 2.结果
• 3.讨论
• （六）结论
• （七）参考文献
• 五、综述Ribosomal Proteins and Colorectal Cancer
• 六、在读期间发表的论文、参加的学术会议和获得的奖励
• 七、致谢