论文摘要
MicroRNA（miRNA）是一类调控基因转录后表达的非编码的小分子RNA。它在生物发育、细胞增殖以及胁迫响应等生命过程中发挥着重要的调控作用。目前,分离和鉴定miRNA的方法主要包括实验方法（遗传筛选、直接克隆）和生物信息学方法。部分miRNA存在表达丰度低,表达组织特异性等特性,用传统的实验法很难发现和鉴定。通过生物信息学方法在已有的各种基因库中寻找未知miRNA,大大提高了人们发现miRNA及其靶基因的效率。芸苔属（Brassica）的成员包括油菜、芜青、甘蓝等,是世界各国主要油料和食用作物。目前,油菜miRNA的分离和鉴定工作已有文献报道,而属内的其它植物尚属空白。本文将拟南芥、水稻等植物已知的miRNA序列分别与芜青、甘蓝、野芥菜、黑芥菜、埃塞俄比亚芥的GSS和EST数据库进行比对搜索,采用一系列标准进行筛选,最后分别在芜青和甘蓝中预测到67个和95个miRNA。而在属内其它物种中未预测到miRNA。我们再把这些预测得到的miRNA分别与芜青和甘蓝的mRNA数据库进行比对搜索,分别找到120个和111个靶基因,除去未知功能及功能不详的,各有62个和48个靶基因。分析结果表明,上述大多数靶基因编码的产物为转录因子及重要代谢酶类,涉及植物的生长发育调控、信号转导及胁迫响应等各个方面。另一方面,这种基于同源性搜索的生物信息学方法往往会遗漏一些物种中特异的miRNA。为此,本实验建立了缺磷、缺硫及镉处理条件下油菜（Brassica napus）的小分子RNA（small RNA,sRNA）的cDNA文库。实验中共检测单克隆3200个,筛选出472个送出测序,得到测序结果420个。除去空载、单引物、无引物以及大小不在17-24bp区间内的序列以及tRNA、rRNA、mRNA断裂片断等序列,最终得到了223个待分析序列。序列分析后,我们得到了miR156、miR159、miR160、miR164、miR167、miR168、miR169、miR393、miR403等9个家族的17个已知的miRNA（包括重复）;同时,得到了miR701、miR702、miR703等3个新的miRNA,并通过比对寻找了这些miRNA的靶基因。我们所克隆到的这些miRNA填补了油莱miRNA的空白。这些工作为后续miRNA的功能鉴定和开发利用奠定了重要的基础。