基于滚环复制放大技术检测DNA及肿瘤细胞

论文摘要

电化学生物传感器集合了生物识别专一性、纳米粒子的生物兼容性及放大性及电化学信号检测的放大作用的优势,具有灵敏度高、选择性好、易于微型化和自动化等优点,是现代生物分析的主要发展方向。本论文主要研制了基于滚环复制放大技术（RCA）及生物条码探针的新型电化学生物传感器,并将此传感器应用在了核酸和肿瘤细胞的检测,灵敏度高,检测限低,有利于超痕量的分析和疾病的早期检测,建立了一种快速、简便、可靠的分析方法;还设计了一种新型的灵敏的化学发光检测方法,在DNA聚合酶I （Klenow fragment）的存在下,通过与Au NPs修饰的错配碱基杂交来检测单核苷酸多态性（SNPs）,取得了较理想的结果。本论文的主要研究内容如下:1研制了一种新型、灵敏的基于滚环复制技术和生物条码技术用于短序列DNA检测的生物传感器,其包括金电极、捕获DNA、经巯基二茂铁和探针DNA（Probe DNA）修饰的金纳米颗粒。捕获DNA和探针DNA分别与目标DNA的两端完全互补,构成了“三明治”DNA双螺旋结构。目标DNA的间接检测是由巯基二茂铁的阳极溶出伏安电化学（DPV）检测实现的。在最佳实验条件下,对1.0×10-176.0×10-15mol/L范围内的靶DNA进行检测,DPV信号强度随靶DNA的浓度增大而增强,检测限为2.8×10-18mol/L。2建立了通过滚环复制技术指数性的放大能力,以适体的高度亲和力识别信号,通过标记在条码DNA上的硫化镉纳米粒子实现电化学检测B淋巴瘤（Ramos）细胞的方法。本方法具有较高的灵敏度和良好的重现性,在细胞浓度为1010000 cell mL-1,有显著的电化学信号,检测到得细胞的最小浓度为10 cell mL-1,从而使单个细胞的检测成为可能。3设计了一种新型的灵敏的化学发光检测方法,在DNA聚合酶I （Klenow fragment）的存在下,通过与Au NPs修饰的错配碱基杂交来检测SNPs。单碱基突变的DNA浓度通过化学发光检测由溶出下来的Au NPs结合的CuS NPs来确定。之所以使用Au NPs,是因为每个Au纳米粒子能结合许多个CuS NPs,因而使灵敏度有较大的提高。通过阳极溶出伏安法来预富集Cu2+,来增强化学发光的信号。通过这两种方法的放大作用,检测限可达1.9×10?17 mol/L SNPs。该方法相对简便且重现性较好,为遗传物质DNA的突变的检测提供了一种可行的手段。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 绪论
• 1.1 电化学DNA 生物传感器
• 1.1.1 DNA 生物传感器的基本原理
• 1.1.2 DNA 生物传感器的分类
• 1.1.3 DNA 生物传感器的设计
• 1.2 滚环复制放大技术
• 1.2.1 滚环复制放大技术概述
• 1.2.2 RCA 技术基本原理
• 1.2.3 RCA 技术的种类
• 1.2.3.1 线性RCA
• 1.2.3.2 指数RCA
• 1.2.3.3 多引物RCA
• 1.2.3.4 免疫RCA
• 1.2.4 RCA 技术的应用
• 1.2.4.1 在核酸测序和全基因组DNA 检测中的应用
• 1.2.4.2 在单核苷酸多态性检测中的应用
• 1.2.4.3 在DNA 芯片和蛋白质芯片中的应用
• 1.3 生物分析中纳米粒子的应用
• 1.3.1 纳米粒子的定义及特征
• 1.3.2 常见纳米粒子的种类
• 1.3.2.1 纳米金粒子
• 1.3.2.2 纳米银粒子
• 1.3.2.3 量子点
• 1.4 课题意义及主要内容
• 参考文献
• 第2章 基于滚环复制放大技术的 DNA 传感器的研制
• 2.1 引言
• 2.2 仪器与试剂
• 2.2.1 仪器设备
• 2.2.2 试剂
• 2.2.3 Au 纳米粒子的制备
• 2.2.4 巯基二茂铁修饰的纳米金粒子DNA 探针的合成
• 2.2.5 滚环核酸扩增（RCA）步骤
• 2.2.6 DNA 生物传感器的制备
• 2.2.7 DPV 电化学检测
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 RCA 步骤及传感器的组装和检测
• 2.3.2 RCA 产物凝胶电泳
• 2.3.3 DNA 传感器构建过程的表征
• 2.3.4 实验条件的选择
• 2.3.4.1 滚环复制时间的选择
• 2.3.4.2 巯基二茂铁与探针DNA 比例的选择
• 2.3.4.3 探针用量的选择
• 2.3.5 实验方法选择性的研究
• 2.3.6 DNA 浓度的测定
• 2.3.7 实验方法在细胞检测中的应用
• 2.4 小结
• 参考文献
• 第3章 基于滚环复制放大技术及适体识别作用检测肿瘤细胞
• 3.1 引言
• 3.2 仪器与试剂
• 3.2.1 仪器设备
• 3.2.2 试剂
• 3.2.3 CdS NPs 的制备及其修饰
• 3.2.4 CdS NPs 标记的单链DNA 的制备
• 3.2.5 MB-DNA-PSM 复合物的组装过程
• 3.2.6 核酸滚环复制放大（RCA）步骤
• 3.2.7 细胞与MB-DNA-PSM-生物条码探针复合物反应
• 3.2.8 3.2.8 CdS 纳米粒子的溶出和电化学检测
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 设计方案及工作原理
• 3.3.2 实验条件的选择
• 3.3.2.1 滚环复制时间的选择
• 3.3.2.2 probe DNA 与aptamer DNA 比例的选择
• 3.3.2.3 细胞孵育时间的选择
• 3.3.2.4 探针用量的选择
• 3.3.2.5 CdS 电化学检测时缓冲溶液的选择
• 3.3.3 实验方法选择性的研究
• 3.3.4 ROMAS 细胞个数的测定
• 3.4 小结
• 参考文献
• 第4章 基于纳米粒子和流动注射化学发光的单碱基突变DNA的检测
• 4.1 引言
• 4.2 仪器与试剂
• 4.2.1 试剂
• 4.2.2 仪器设备
• 4.2.3 Au NPs 的制备
• 4.2.4 CuS NPs 的制备
• 4.2.5 CuS NPs 修饰的鸟嘌呤探针的制备
• 4.2.6 修饰有信号DNA、Au NPs、CuS NPs 的鸟嘌呤探针的制备
• 4.2.7 Au NPs 修饰的CL 传感器的制备
• 4.2.8 流动注射化学发光检测
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 DNA 传感器的工作原理
• 4.3.2 实验条件的优化
• 4.3.3 SNP 的CL 定量检测
• 4.3.4 血样中HBV DNA 序列的检测
• 4.4 小结
• 参考文献
• 结论
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文目录