一、不同保存方法对结核菌素效价的影响（论文文献综述）
房立春[1]（2020）在《基于RNA-Seq技术的牛结核病分子标志物的筛选和验证》文中进行了进一步梳理牛结核病（Bovine tuberculosis）是一种主要由牛型分枝杆菌（M.bovis）感染引起的危害严重的人畜共患病。结核病牛可通过鼻腔或泌乳等方式向外排菌,呼吸道飞沫传播是牛分枝杆菌的主要传播方式。世界动物卫生组织（OIE）推荐的巢式PCR方法可以有效检测牛鼻拭子中分枝杆菌DNA,有研究报道基于此方法发现超过15%的结核病牛向外排菌。为了筛选牛结核病特别是不同感染状态牛结核病的诊断用分子标志物,本研究采用皮内变态反应（TST）和IFN-γ释放试验（IGRA）在临床上筛选结核病阳性牛（bTB,n=40）和健康牛（NC,n=20）,并采用OIE推荐的巢式PCR方法将结核病阳性牛分为PCR阳性结核病牛（bTB PCR-P,n=20）和PCR阴性结核病牛（bTB PCR-N,n=20）。以牛型提纯结核菌素PPD-B刺激牛外周血淋巴细胞（PBMCs）6 h,并设PBS刺激组为对照。采用RNA-Seq技术对PBMCs总RNA进行高通量测序,描绘不同感染状态结核病牛的转录表达谱。结果显示在PPD-B刺激和非刺激条件下,不同感染状态结核病牛PBMCs的mRNA表达谱显着不同,组间鉴定到数目可观的差异表达基因,差异表达基因功能和所涉及的信号通路揭示了结核病牛在不同感染状态下特有的生理特征。本研究基于转录组学结果,筛选了12个有潜力的牛结核病分子标志物。以临床筛选的51头牛为独立样本,扩群验证了分子标志物的诊断能力。qRT-PCR结果表明PPD-B刺激条件下IL-8,和LTA在结核病阳性牛（包括PCR阳性和PCR阴性结核病牛）中的mRNA表达水平显着高于健康牛,受试者特征曲线（ROC曲线）显示IL-8（AUC=0.9991）和LTA（AUC=0.9343）具有较高的诊断应用价值;PPD-B刺激条件下BCL2（AUC=0.9100）,CRP（AUC=0.9619）和CHI3L1（AUC=0.8893）可以将临床上PCR阳性和PCR阴性的结核病牛进行有效区分。由于商品化的牛ELISA试剂盒的限制,我们评价了分子标志物IL-8和CRP在结核病牛血浆中的蛋白含量并确定了诊断用cutoff值。双盲试验以244头牛为实验动物,分别用TST,IGRA,nest-PCR和PPD-B刺激的IL-8与CRP ELISA进行检测,结果表明PPD-B刺激下血浆IL-8与TST（κ=0.877）和IGRA（κ=0.926）均具有很高的吻合度,可以用于区分结核病牛与健康牛;PPD-B刺激下血浆CRP与nest-PCR（κ=0.9117）有较高吻合度,可以区分临床上PCR阳性和PCR阴性的结核病牛。本研究成功构建了牛分枝杆菌BALB/c小鼠感染模型。以牛分枝杆菌AN5静脉注射小鼠,同时设对照组。连续观察56天,不论是脏器系数,组织病理学观察还是脏器载菌量均表明感染模型建模成功。利用qRT-PCR和ELISA在mRNA和蛋白水平验证了牛结核病分子标志物在小鼠模型上不同感染时间的表达情况。结果证实,LTA,CRP,BCL2等分子标志物在小鼠感染模型与牛上的表达水平基本一致,该结果进一步提高了分子标志物的可靠性。综上所述,本研究首次描绘了不同感染状态结核病牛PBMCs的转录表达谱,阐明了不同感染状态结核病牛生理状态的异质性,证实了PCR阳性与PCR阴性结核病牛不同的免疫应答反应。同时筛选并验证了IL-8、LTA、CRP、BCL2和CHI3L1是具有诊断价值的牛结核病分子标志物。本研究提供了新的视角来认识牛结核病发病进程,为牛结核病不同感染状态的区分提供了理论支持,新型分子标志物的成功筛选和验证为牛结核病的临床诊断提供了客观依据。
叶俊[2]（2020）在《牛结核分枝杆菌病感染早期分泌性蛋白MPB 70、MPB 83单克隆抗体的制备及应用》文中研究表明分枝杆菌,经研究证实归为革兰氏阳性抗酸杆菌中的一类,作为常在菌生存于日常生活环境之中。分枝杆菌也可以分成许多种类,其中一类因为有共同的抗原蛋白可构成结核分枝杆菌复合群。大多数分枝杆菌的菌株生长极为缓慢,有些能够引起人和动物结核及结核样疾病。牛结核分枝杆菌特有的早期感染标识性分泌蛋白是MPB 70和MPB 83蛋白,它们主要应用于在菌株的鉴定和疫苗的研究之中。在利用DNAstar7.0软件综合分析牛型结核分枝杆菌早期标识性分泌性蛋白MPB 70和MPB 83抗原基础上,筛选确定了 MPB 70和MPB 83蛋白编码基因主要抗原域,利用重叠延伸PCR技术,构建了 MPB 70和MPB 83串联重组体。将其连接到原核表达载体pGEX-6p-1,进行诱导和表达。研究获得了一种具有抗原性的牛结核分枝杆菌感染早期标识物MPB 70和MPB 83分泌性蛋白的串联抗原,利用DNAstar7.0生物信息软件对牛结核分枝杆菌感染早期标识性分泌性蛋白MPB 70和MPB 83抗原结构区域进行预测,并设计合成克隆引物,构建重组后的载体得到了高效表达,再加上单克隆抗体的顺利制备,检测纯化后重组蛋白的纯度及抗体效价表达。该实验获得了具有抗原活性的牛结核分枝杆菌感染早期分泌性蛋白串联抗原MPB 70+MPB 83,为后续进一步研发牛结核分枝杆菌早期感染标识物快速检测试剂盒奠定了坚实的研究基础。
许芳[3]（2020）在《我国部分地区牛结核病调查与牛肺外结核病病原分离鉴定及生物学特性研究》文中研究说明牛结核病（bovine tuberculosis,bTB）是一种主要由牛分枝杆菌（Mycobacterium bovis,M.bovis）感染引起的慢性消耗性人兽共患传染病。该病可通过病牛咳嗽喷出的飞沫或悬浮在空气中的带菌尘埃经呼吸道传播,也可通过摄取带菌的食物、饮水而经消化道传播。症状因发病部位不同而异,常表现为肺结核和淋巴结核,也可出现乳房结核、浆膜结核和肠结核等其他组织器官结核。我国是bTB高负担国家,流行率约为015%,资料表明,建国后,我国bTB的主要表现形式为肺结核,其他国家普遍实行牛奶巴氏灭菌后bTB表现形式也是以肺结核为主。但是,进入21世纪,全国bTB流行病学调查发现一个令人困惑的普遍现象:采用PPD方法检疫结果呈阳性的牛无咳嗽等呼吸道症状,剖检极少发现肺脏结核病变。为进一步了解我国部分地区bTB的流行情况,揭示奶牛场PPD阳性牛与剖检肺脏结核病变不对应、不吻合的原因,探究其传染源、传播途径及病原特性,本研究在14个省份及新疆生产建设兵团开展bTB流行病学调查,选取8个规模化奶牛场进行免疫学综合诊断、系统剖检、病理组织学检查、病原分离鉴定、动物致病性试验、菌株全基因组测序、系统进化分析等生物学特性研究。1.2015-2018年,采用比较皮内变态反应（SICCT）和IFN-γ试验对我国14个省份和新疆生产建设兵团进行bTB流行病学调查,并采集SICCT或IFN-γ试验阳性牛病料,进行细菌分离鉴定。利用SICCT方法,共计在6,943头牛中检出阳性1,594头,平均个体阳性率为22.96%;共计在185个场户中检出阳性场114个,平均场群阳性率为61.62%。IFN-γ试验共计在8,677头牛中检出阳性1,786头,平均个体阳性率为20.58%;共计在236个场户中检出阳性场150个,平均场群阳性率为63.56%。共计从64.44%（87/135）的bTB阳性牛中分离到细菌,分离株经结核分枝杆菌复合群两级多重PCR鉴定,其中72株为M.bovis,11株为M.avium,4株为其他分枝杆菌。流行病学调查结果显示,我国部分地区bTB阳性率仍呈高流行态势,14个省份和新疆生产建设兵团均有bTB流行。但现场调查发现,PPD或IFN-γ试验阳性牛很少表现咳嗽、呼吸困难和极度消瘦等典型肺结核症状,而且,由于上述原因,在基层出现了对bTB阳性牛扑杀正当性的怀疑及正常检疫难以实施的现象。2.为调查目前规模化奶牛场bTB的表现形式,揭示PPD阳性牛与剖检肺脏病变不吻合的真实原因,并确定其传染源及传播途径,对3个省份8个规模化奶牛场的13,345头奶牛进行SICT、SICCT、IFN-γ试验、PPD点眼反应和ELISA抗体检测5种免疫学综合诊断,剖检后期感染牛并采集病料进行病理组织学检查和病原分离鉴定。结果显示,综合判定后期感染牛752头,剖检151头,有131头（86.75%）眼观可见明显结核病变,其中119头（占90.84%）病变发生在肝脏、脾脏、肠系膜淋巴结、乳房淋巴结等肺外组织器官,仅12头（占9.16%）病变发生在肺脏。HE染色表明151头剖检牛组织切片镜下均可见不同程度的结核病理变化,Ziehl-Neelsen抗酸染色显示26头牛组织切片中可见红染的结核杆菌。并从60.26%（91/151）的剖检阳性牛中分离到细菌,且经qPCR、GeneXpert MTB/RIF和Enigma鉴定均为M.bovis。综合诊断结果表明,8个规模化奶牛场bTB主要表现为肺外结核,病变主要分布在肠系膜淋巴结、肠道、肝脏和脾脏等肺外组织器官,且值得注意的是,71.26%的肺外结核与胃肠道有关。而且现场调查、临床表现、剖检病变、病理组织学检查、病原分离鉴定结果均提示试验牛场肺外结核的传播途径可能是消化道,主要或因牛饮食被M.bovis污染的牛奶或饲草料而感染。3.为验证试验牛场肺外结核的传染源及传播途径,从8个规模化奶牛场共采集54份奶样（其中8份为来自8个牛场的产房混合乳,46份为阳性牛奶样）、54份粪便（其中8份为来自8个牛场粪便处理池的混合粪便样品,46份为阳性牛粪便样品）分别进行qPCR检测和细菌分离培养。qPCR结果显示,8份产房混合乳均为M.bovis核酸阳性,39份阳性牛奶样为M.bovis核酸阳性;8份混合粪便均为M.bovis核酸阳性,34份阳性牛粪便样品为M.bovis核酸阳性。从54份奶样中分离培养出12株M.bovis,但未从粪便中成功分离出M.bovis。结果表明,8个规模化奶牛场肺外结核是经由产房带菌的初乳和常乳以及粪口传播引起的消化道传播所致。4.为研究分离株的致病性,选择代表性分离株（113、105）和阳性对照菌株（M.bovis AN5）进行家兔感染试验。分组并经腹腔注射、口服、滴鼻3种途径感染家兔,8周后剖检,无菌采集各组家兔组织器官进行病理组织学检查和组织匀浆活菌培养。家兔病理组织学变化主要发生在肺脏、肺门淋巴结、肠系膜淋巴结和脾脏,可见典型肉芽肿病变,三层结构清晰,中心干酪样坏死层、上皮样细胞和多核巨细胞构成的特殊肉芽层和淋巴细胞构成的普通肉芽组织层,还可见马蹄样或花环状的郎罕氏巨细胞存在,其他组织镜下未见病变。Z-N抗酸染色在肺脏、肺门淋巴结、肠系膜淋巴结可见红染杆状细菌。实验组家兔剖检病变比阳性对照组家兔剖检病变累及范围更广泛,病变程度更严重,从实验组和阳性对照组家兔体内均可回收到细菌,且实验组CFU高于阳性对照组,表明肺外结核分离株表现出较强的致病性,具有感染牛并在牛群中传播的潜在风险。5.利用24位点MIRU-VNTR基因分型方法对分离株进行基因分型,并对典型菌株进行全基因组测序和系统进化分析。MIRU-VNTR基因分型结果表明,分离株聚类为三个大群,同一地区分离株亲缘关系较近,可能来自相同的进化分枝,且M.bovis具有独特的地理性差异。对10株分离株进行全基因组测序,同源性分析表明10株分离株均为M.bovis,与标准株M.bovis AF2122/97同源性在98.80%99.31%;系统发育分析表明10株分离株分为两簇,分别与M.bovis AF2122/97和M.bovis 30亲缘关系较近。综上所述,这是我国首次对bTB肺外组织器官病变分布进行详细调查,证实经消化道传播的肺外结核在我国多个省份奶牛场呈现高患病率。本研究确定了我国部分省份bTB的流行特征,建立了肺外结核综合诊断策略,并确定了肺外结核分离株的致病能力。为当前行业存在的PPD阳性牛扑杀难的问题提供了有力证据,为大型牧场快速降低bTB阳性率提供了诊断策略和防控指导,为我国bTB流行株的溯源及遗传特征分析提供了数据支持,也为我国制定bTB控制和根除计划提供了决策依据。
柏极[4]（2020）在《抗结核分枝杆菌脂阿拉伯甘露聚糖荧光抗体的制备》文中研究指明目的制备抗结核分枝杆菌脂阿拉伯甘露聚糖（Lipoarabinomanan,LAM）荧光抗体,为应用于痰涂片镜检打下基础。方法LAM经兔皮下免疫后,采用酶联免疫吸附法（ELISA法）检测抗体效价,兔心脏采血获得足量高效价的兔血清。兔血清依次经过盐析法粗提,G蛋白亲和层析纯化抗体,通过SDS-PAGE鉴定纯化效果,透析除盐后浓缩,BCA法检测抗体浓度。经荧光素异硫氰酸酯（FITC）偶联,测定F/P值,获得荧光抗体。结果成功进行6次LAM兔皮下免疫,成功构建ELISA法检测抗体效价,测得抗体效价达到1:51200,顺利行心脏采血,获得约100 mL含抗LAM抗体兔血清。顺利完成盐析法,G蛋白亲和层析纯化抗体,经SDS-PAGE鉴定,获得了高纯度多克隆IgG。抗体经除盐浓缩,BCA法测定抗体浓度为7.26 mg/mL。经FITC偶联,制备荧光抗体,测F/P值2.7。结论成功制备荧光抗体,为建立直接免疫荧光法检测痰中结核分枝杆菌打下基础。
解晓莉,孙阳阳,程凯慧,楚会萌,张亮,王基隆,杨美,杨宏军[5]（2019）在《副结核分支杆菌MAP0862蛋白的表达及临床应用》文中研究指明本研究以腹泻牛粪便基因组DNA为模板,扩增MAP0862基因,构建重组表达载体pET-30a（+）-MAP0862和pEGX-6P-1-MAP0862,通过原核表达系统表达His-MAP0862和GST-MAP0862蛋白,经纯化后制备兔源高免血清,建立ELISA特异性检测方法,最后将纯化蛋白和ELISA方法用于牛副结核病临床样品检测,并对检测数据进行分析。结果表明,以MAP0862蛋白为检测原建立的ELISA检测方法在临床样品检测中具有较高的特异性和敏感性,说明MAP0862蛋白适用于副结核病抗体检测。本研究建立的ELISA检测方法可有效检测临床样品中副结核病的感染。
王子健[6]（2018）在《水牛结核病诊断方法的建立与评价》文中提出中国拥有丰富的水牛（Bubalus bubalus,Bb）资源,同奶牛一样受到牛结核病（Bovine Tuberculosis,b TB）的威胁,而患病牛又是人结核病的重要传染源。我国水牛结核病的控制措施为“检测扑杀”,所以准确检测是有效控制水牛结核病的关键。水牛结核病的检测方法都是沿用奶牛结核病诊断方法和判断标准。因为水牛与奶牛在分类上同为牛科但不同属的物种,用于奶牛结核病的检测方法在水牛的准确度较低。因此,本研究旨在评价牛结核菌素皮内变态反应（简称皮试法）在水牛上的应用。同时,建立水牛结核病γ-干扰素检测方法。主要结果如下:水牛结核病阳性样本的建立首先用皮试法与抗体检测法检测水牛样品,确定免疫接种之前所选水牛为阴性,判定标准是两种方法皆为阴性则判定为阴性;随后用BCG接种水牛,制造标准阳性样本,再于不同时间分别检测结核抗体水平与皮试差异值,判定标准是两种方法中有一种为阳性则判定为转阳。经过动物实验,最终成功得到阴性样本71头,接种BCG后,累计转阳45头。水牛皮试法的标准化利用得到的水牛皮试法检测结果与前期奶牛皮试法检测结果进行比对与分析。首先确认水牛与奶牛的皮厚值之间存在明显差异,随后确认不同品种水牛之间的皮厚值无明显差异。再通过比较免疫BCG后不同时间的皮试检测结果,分析不同时间的皮厚差变化与判定标准的变化,最后将数据进行汇总,绘制ROC曲线,确定cut-off值为2.495mm。抗水牛IFN-γ单克隆抗体与多克隆抗体的制备利用原核表达的水牛γ-IFN（Bb IFN-γ）免疫小鼠与大耳白兔,制备单克隆抗体与多克隆抗体,经过筛选,成功得到6株稳定分泌Ig M型抗体的单克隆细胞,命名为:2A9、7C4、9B6、9H2、10E2、10H4。免疫三只大耳白兔,得到3批兔高免血清,制备多克隆抗体后的效价分别为2.56×104、5.12×104、1.02×105,其中3号兔血清效价最高,为1.02×105。综上所述,本研究成功确定了水牛皮试法的诊断标准,并制备了抗水牛IFN-γ单克隆抗体与多克隆抗体,为下一步IFN-γ的检测奠定基础,同时也为水牛结核病的综合防控提供支持。
任宁宁[7]（2018）在《结核分枝杆菌RD区诊断标识抗原的筛选及卡介苗突变体库的构建》文中研究表明结核病（tuberculosis,TB）是一种慢性消耗性的人兽共患传染病,由结核分枝杆菌复合群（Mycobacterium tuberculosis Complex,MTBC）所引起。据世界卫生组织（WHO）估计,2016年的全球结核病的发病例约为1040万,死亡约130万例。结核病已经成为了单一病原菌致死疾病的首位。近来,WHO制定了“消灭结核病策略”,最终目标在2035年消灭结核病。众所周知,早期的诊断和适当治疗可以预防大多数人死于结核病。因此,亟待需要开发一种高效的结核病诊断方法。基于血清学诊断技术而建立起来的间接ELISA检测、操作简单迅速,且以WHO倡导的无痰样本为检测对象,是结核病诊断技术的研发热点。然而,目前并没有较为理想的商品化ELISA诊断试剂盒,特别是针对肺外结核（EPTB）及早期痰涂片阴性肺结核（PTB-SN）的诊断。因此,开发新的诊断方法潜在策略之一就是筛选新的抗原候选物。本实验从牛分枝杆菌（M.bovis）、卡介苗相对结核分枝杆菌（M.tb）基因组的差异区域入手,对差异区（RD）的129个开放阅读框（ORFs）分别进行克隆和原核表达与纯化,利用临床肺结核（PTB）及肺外结核（EPTB）样本对RD蛋白进行筛选,以期筛选出针对不同类型结核病的新型诊断标识;同时,构建BCG突变体库,从突变库中筛选生物膜成膜能力加强的突变体。主要研究内容和结果如下:（1）RD区基因的克隆、表达与纯化对RD区的129个基因分别进行克隆,选择p ET-32a作为融合载体,经过酶切、连接和测序鉴定,成功构建了78个重组质粒,涉及到除RD12区域外的其他15个RD区的基因。经过IPTG诱导,获得68个表达的蛋白。根据功能注释,数量较多的前5类蛋白为:假想蛋白、噬菌体蛋白、膜/跨膜蛋白、分泌型蛋白、转录调控蛋白。最后对蛋白进行纯化,其中有7个蛋白是可溶性表达,它们分别为Rv0222、Rv0311、Rv1766、Rv1767、Rv1976c、Rv2660c和Rv3120;其他均为非可溶性表达。（2）RD蛋白的初步筛选临床PTB、EPTB标准阳性血清的确定:从武汉市医疗救治中心收集有明显临床症状并确诊的肺结核及肺外结核病人血清,经过实验室建立的人IFN-γ体外2018释放法（IGRA）及TB-DOT商品化试剂盒对临床结核病人血清做进一步检测,选择6份双阳性血清,每3份进行等量混合作为标准阳性血清。标准阴性血清的确定:来自本校的志愿者样本,经过PPD皮试、IGRA法及TB-DOT商品化试剂盒检测,选择6份3种方法检测均阴性的血清,每3份进行等量混合作为标准阴性血清。以OD630阳性血清/OD630阴性血清（P/N）≥2作为初筛标准,用i ELISA方法对68个蛋白分别进行筛选,得到29个蛋白与标准阳性血清有特异性识别反应。其中肺结核组阳性血清筛选到19个抗原,包括Rv3872、Rv3874、Rv3875及Rv1981c等,所在区域分布在RD1-RD4、RD6、RD8、RD10-RD11、RD13、RD15-RD16;肺外结核阳性血清筛选到14个抗原,如Rv3872、Rv1577c、Rv1508c及Rv1514c等,所在区域分布在RD1-RD4、RD6、RD8、RD10、RD13-RD14、RD16。而Rv3872（RD1）、Rv0222（RD4）、Rv0309（RD8）和Rv3403c（RD16）四种抗原被以上2种结核病阳性血清共同筛选到。（3）潜在标识抗原的复筛经过受试者工作曲线（ROC）分析,在PTB组,Rv0222与Rv3403c显示出最高的曲线下面积（AUC）值,分别为0.8247（95%CI,0.7496-0.8997）和0.8223（95%CI,0.7431-0.9015）,对应ESAT6/CFP10的AUC值为0.7468（95%CI,0.6576-0.8360）。即Rv0222和Rv3403c在肺结核涂片阳性组（PTB-SP）中表现出最高的诊断能力（83.3%/80%,79.1%/80%）,而Rv3403c在PTB-SN中表现出最高的诊断能力（敏感性:70%,特异性:80%）。在EPTB组,Rv0222展示出最高的诊断价值（AUC:0.7706,敏感性:70%,特异性:82.5%）,对应ESAT6/CFP10的AUC值为0.7394（95%CI,0.6092-0.8695）,敏感性为60%,特异性为70%。且联合Rv0222与Rv3403c蛋白能提高PTB-SN患者的检出率,对应的敏感性特异性分别为86.6%和72.5%。（4）Rv0222与Rv3403c蛋白的免疫学评估Rv0222与Rv3403c蛋白免疫小鼠后,小鼠血清中抗Rv0222的抗体总Ig G效价为211×100,同时也测得Ig G1与Ig G2a亚型的效价为212×100与210×100;检测抗Rv3403c总抗体Ig G效价为212×100,Ig G1与Ig G2a亚型的效价同样为212×100与210×100。PBS免疫组并未检测到抗体滴度。分离的脾淋巴细胞经Rv0222和Rv3403c刺激后,蛋白免疫组与PBS免疫组的刺激指数有差异（p<0.05）。且蛋白免疫组的细胞上清中IFN-γ与TNF-α的浓度高于PBS免疫组,差异极显着（p<0.01和p<0.001）。（5）卡介苗生物膜相关突变体库的构建用Myco Mar T7转座子系统获得了3170株卡介苗突变体文库,随机挑取1000株突变体进行PCR鉴定,有960株扩增出目的条带,预估转导效率高达96%。进而对鉴定成功的突变体转接到Sauton液体培养基进行成膜能力的初步筛选,其中148株突变体成膜能力较BCG增强。综上所述,来自RD4区的Rv0222和RD16区的Rv3403c均具有潜在的结核病抗体诊断能力,特别在难以诊断的肺外结核、早期的涂阴肺结核的检测灵敏度高于其他候选抗原。且这2个抗原免疫小鼠后,均能诱导高滴度的总Ig G、Ig G1与Ig G2a抗体产生和高浓度IFN-γ和TNF-α的分泌,表明这两个蛋白在小鼠体内能诱导Th1/Th2混合型免疫应答。其中,未知功能蛋白Rv3403c的相关结果为首次报道。此外,构建了卡介苗生物膜相关的突变体文库,为后期研究分枝杆菌生物膜与疫苗的相关性提供了基础。
彭永[8]（2018）在《副结核分枝杆菌分离及小鼠感染模型的建立》文中提出副结核病（Paratuberculosis）是由副结核分枝杆菌（Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis MAP）引起的慢性肠道炎症,主要感染反刍动物,在世界范围内均有广泛流行,目前尚未有国家宣布消灭副结核病。副结核病病程长,一般分为亚临床期和临床期,前者以细胞免疫为主,后者以体液免疫为主要方式。亚临床期持续时间较长,感染动物带菌但不排菌,且不表现出明显的腹泻等临床症状。当前,有关我国牛副结核病的流行情况报道较少。为了解牛副结核病在给我国局部地区的流行状况,本研究采用皮肤迟发性过敏反应（SDTH）、酶联免疫吸附试验（ELISA）和PCR的方法,随机抽取山东地区3个奶牛场共1023头牛进行了检测。SDTH检测到的阳性牛为113头,可疑17头,群体阳性率为11.05%。不同牧场间阳性率水平差别较大,最高为20.16%,最低为6.45%。ELISA检测到的阳性牛为75头,群体阳性率为7.33%。抗体阳性率最高的牧场为16.05%,最低的为3.75%。对ELISA结果阳性牛进行粪便采集,提取粪便基因组进行IS900特异性片段PCR检测,共检测样本74份,阳性3份,阳性率为4.05%。流行病学调查结果显示,副结核病在山东地区牛场中普遍存在,部分牛场阳性率较高,副结核病已成为我国牛场面临的重要传染病之一。为了加强对副结核的病原研究,我们对皮肤迟发性过敏反应（SDTH）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、PCR均检测为阳性的牛2头、临床上表现出较强拉稀症状的牛7头,共9头牛进行了副结核分枝杆菌的分离研究。根据副结核分枝杆菌的抗酸特性,采用化学处理与抗生素处理法相结合,成功探索得到一种既能够抑制样本中杂菌生长,又能够保持样本中副结核分枝杆菌活性的方法。通过该方法,从两个不同牧场分离得到4株副结核分枝杆菌。对分离菌进行副结核分枝杆菌基因组IS1311特异性片段酶切验证,证实4个分离株均为S型副结核分枝杆菌,分别命名为pTB-SD-01,pTB-SD-02,pTB-SD-03,pTB-SD-04。为探索副结核分离株的动物感染特性,本研究将副结核分枝杆菌分离株pTB-SD-01、pTB-SD-03,以及副结核分枝杆菌标准弱毒参考株316F、强毒参考株株Ⅲ-Ⅴ,分别感染C57B/L小鼠,在不同时间点检测小鼠外周血中IL-6、IL-10、IFN-γ以及β-actin等细胞因子的转录变化情况;通过ELISA方法检测副结核分枝杆菌抗体消长的情况,从细胞免疫与体液免疫两个方面全面分析不同毒力副结核分枝杆菌感染动物的生物学特性,初步建立了副结核分枝杆菌动物感染模型。
姜勇[9]（2012）在《猕猴IFN-γ基因的克隆表达及其检测方法的建立》文中认为结核病是一种人兽共患的慢性消耗性传染病,是目前致死亡人数最多的传染病,由结核分枝杆菌复合群（Mycobacterium tuberculosis complex, MTC）成员引起。猕猴（Macaca mulatta, Mm）为我国Ⅱ级重点保护野生动物,也是医学研究中具有很高价值的实验动物,在我国分布广泛。非人灵长类是结核病的敏感物种,其中猕猴最为易感。猴群发生结核病,会导致猴群的损失,同时实验猴发生结核分枝杆菌感染会对实验项目产生严重干扰,并可能传染人。目前,尚无有效疫苗预防猕猴结核病,控制猕猴结核病的主要措施是“检疫—扑杀”。因此,一种敏感性和特异性俱佳的猕猴结核病检测方法是实施该措施的前提条件。结核菌素皮肤试验（tuberculin skin test, TST）是目前最常用的结核病检测方法。此方法操作繁琐,主观性强,假阳性率高。干扰素是一种具有多种生物活性的低分子量糖蛋白,结核分枝杆菌感染能刺激体内免疫细胞产生IFN-γ。利用这一原理建立的结核病IFN-γ体外释放检测法在发达国家已被广泛用于牛结核和人结核的感染检测。国外也有猴结核IFN-γ检测试剂盒。但这些产品均价格高,且货源难得。本研究旨在自主建立猕猴结核IFN-y检测法,为我国猕猴结核的诊断与防控提供技术手段。主要研究内容包括：克隆猕猴IFN-γ（MmIFN-y）基因,进行了原核和真核表达,进一步纯化了IFN-γ重组蛋白,制备和筛选了抗MmIFN-y的单克隆抗体；制备了抗MmIFN-y的多克隆抗体。在此基础上建立了检测MmIFN-y的间接夹心ELISA方法,通过临床样本检测验证了该方法的可行性。1.猕猴IFN-γ的克隆与原核和酵母表达根据本实验室保存的猕猴IFN-γ cDNA设计一对引物并进行扩增,将MmIFN-y基因克隆至原核表达载体pET-30a,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导,结果成功表达出大小为24kDa左右的His-tag-MmIFN-y重组融合蛋白。同时,根据本实验室保存的猕猴IFN-γ cDNA设计另一对引物并进行扩增,进一步将MmIFN-y基因克隆至酵母表达载体pPICZaA,电转化酵母GS115感受态细胞,经甲醇诱导,结果表达出17kDa的MmIFN-γ和约22kDa的糖基化重组MmIFN-y蛋白。2.猕猴IFN-γ单克隆抗体、多克隆抗体的制备以及鉴定利用原核表达的MmIFN-y免疫Balb/C小鼠,用原核表达的MmIFN-y建立间接ELISA筛选杂交瘤细胞株,获得10株单克隆抗体,分别命名为2A1、2C3、2F6、2H8、3A1、3B2、3E5、3F6、3G7、3H9。单抗腹水效价在3.2×103（3G7）-6.5×106（2A1）之间,单抗相对亲和力在104-107之间。间接ELISA表明10株单抗都能和酵母表达MmIFN-y进行反应。利用原核表达的MmIFN-y免疫日本大耳白兔,获得高免血清,经纯化获得兔抗MmIFN-y多克隆抗体,ELISA抗体效价为5.12×104。3.间接双夹心ELISA方法的建立和应用用2F6株单抗、多抗及HRP标记的羊抗兔IgG,建立检测MmIFN-y的双夹心ELISA万法。此ELISA方法检测原核表达的MmIFN-y灵敏度达到125pg/mL,同时能检测猕猴天然IFN-y。用该方法检测了7份结核菌素皮试阴性猴的外周血细胞经牛PPD刺激后的培养液,结果全为阴性。检测阴性猴外周血细胞ConA刺激后的培养液,结果为阳性。检测灵敏度为125pg/mL时,其对应OD630值为0.18,相当于7份阴性样本的OD630平均值+3.5SD。一般阳性样本判断值标准为OD630值+2-3SD,因此,推测本试剂盒能够用作猕猴结核病的检测。此外,据报道,结核感染猕猴的全血经PPD刺激后释放的IFN-γ量都在200pg／mL以上。因此,虽然本本研究尚未应用于结核感染阳性猕猴的检测,但所建立的ELISA方法为猕猴结核病的检测和防治奠定了良好基础。
邹新峰[10]（2011）在《水牛IFN-γ克隆表达及其单克隆抗体的制备与应用》文中进行了进一步梳理水牛（Bubalus bubalus, Bb）,哺乳纲牛科（Bovidae）水牛属,适宜于水田耕作。水牛奶质十分优良,所含蛋白质、氨基酸、乳脂、维生素、微量元素等均高于黑白花牛奶,其营养价值相当于黑白花牛奶的两倍,作为一类高级营养食品,水牛奶制品日渐成人们消费的“新宠”,在商业上具有潜在的巨大的价值。水牛肉,特别是小水牛肉,味香、鲜嫩,且脂肪含量少。另外,水牛角可以入中药。中国是水牛资源十分丰富的国家,据联合国粮农组织（FAO）统计资料,截止2003年,我国水牛饲养量为2275.9万头,已上升为世界第三位。结核病（Tuberculosis）由结核分枝杆菌引起的人畜共患病。人接触患结核病的水牛或者食用未经消毒的患结核病水牛的奶,会引起人的结核病。水牛感染结核病,成为制约奶水牛发展的潜在威胁。到目前为止,我国水牛结核病检疫还没有一套完整可行的方法,一直是采用黄牛的检测标准进行检测,即结核菌素皮内试验（TST）。TST为法定的黄牛结核病检疫方法,应用该标准检测水牛结核病误差较大,不适合水牛的检测。因此,寻找一种新型的水牛结核病检测方法迫在眉睫。干扰素是一类具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用的多种功能的免疫活性蛋白。γ-干扰素（IFN-γ）是Ⅱ型干扰素,IFN-γ体外释放法是目前检测结核病最具有应用前景的检测方法之一,它是在特异性抗IFN-γ单克隆抗体的基础上建立的对于待检样品中IFN-γ定性定量分析的一种实验方法。国外学者已经将抗原特异性IFN-γ试验的应用于多种动物疫病的检测。相对而言,水牛抗原特异性IFN-γ试验研究报道较少。本研究克隆表达并纯化了水牛IFN-γ（BbIFN-γ）,对其进行了抗病毒活性分析,制备了抗BbIFN-γ单克隆抗体与多克隆抗体,并在此基础上建立了检测BbIFN-γ的双抗体夹心ELISA方法。1.水牛IFN-y的克隆与原核/酵母表达通过Con A刺激,从水牛全血中提取BbIFN-γmRNA,根据GenBank上发布的广西沼泽型水牛的IFN-y mRNA序列设计引物,扩增出cDNA,克隆到原核表达载体pET-30a,转化BL21,经IPTG诱导,表达出大小为22kD左右的可溶性重组蛋白。根据测序结果,把密码子改为毕赤酵母偏爱密码子并全基因合成,亚克隆到酵母穿梭质粒pPICZaA,转化酵母感受态GS115,经甲醇诱导,表达出18kD左右的蛋白。2.水牛IFN-y抗VSV/IBRV病毒活性的鉴定为了鉴定原核和酵母表达的蛋白是否具有抗病毒活性,检测了IFN-y抑制水疱性口炎病毒（VSV）和牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）在牛肾细胞系（MDBK）的增殖能力。结果显示,原核表达与酵母表达的两种蛋白的抗VSV活性分别为2.05×105U/mL和7.44×105U/mL,抗IBRV活性分别为5.22×104U/mL和2.61×105U/mL。所表达的两种重组BbINF-γ蛋白均具有抗病毒活性,原核表达的蛋白抗IBRV活性比酵母表达的偏低。3.水牛IFN-γ单/多克隆抗体的制备与鉴定本研究利用两种表达蛋白混合免疫Balb/C小鼠,并用两种蛋白分别筛选杂交瘤细胞株,获得五株高效价的单克隆抗体,分别命名为1C3、2C3、3E7、4G6、4H4,腹水效价分别为2.56×104、5.12×104、1.28×104、2.56×104、5.12×104。Western blot分析显示五株单抗均能特异性结合BbIFN-γ,表明五株单抗均为BbIFN-γ的特异性单抗。间接ELISA表明,McAb不与其他抗原反应,进一步证实其特异性良好。利用两种表达蛋白混合免疫日本大耳白兔,获得兔高免血清,经纯化得到多克隆抗体,Western blot分析显示多抗能特异性结合BbIFN-γ4.双抗体夹心ELISA方法的建立用2C3株单抗、多抗及辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔IgG,建立双抗体夹心ELISA方法,检测BbIFN-γ,结果其检测的灵敏度达到125pg/mL,灵敏度高。该方法的建立为定量检测BbIFN-γ试剂盒的研制奠定了基础。该研究建立了高效的检测BbIFN-γ的免疫学方法,为水牛结核病的检测和防治奠定了基础。
二、不同保存方法对结核菌素效价的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、不同保存方法对结核菌素效价的影响（论文提纲范文）
（1）基于RNA-Seq技术的牛结核病分子标志物的筛选和验证（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 牛结核病的概述 |
| 1.2 牛结核病的危害与防控 |
| 1.2.1 牛结核病的危害 |
| 1.2.2 国内外牛结核病的防控现状 |
| 1.3 牛结核病的诊断方法 |
| 1.3.1 临床诊断 |
| 1.3.2 尸检诊断 |
| 1.3.3 组织病理学诊断 |
| 1.3.4 免疫学诊断 |
| 1.3.5 分子生物学诊断 |
| 1.4 牛结核病诊断标志物的研究进展 |
| 1.5 RNA测序技术概况 |
| 1.6 目的与意义 |
| 第二章 不同感染状态结核病牛外周血淋巴细胞转录组学分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 主要试剂与耗材 |
| 2.1.2 主要仪器与设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 样品制备 |
| 2.2.2 测序文库构建和转录组测序 |
| 2.2.3 高通量测序数据处理及差异表达基因的筛选 |
| 2.2.4 不同感染状态结核病牛差异表达基因分析 |
| 2.2.5 应用qRT-PCR验证转录组数据 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 实验动物的筛选及测序样品的制备 |
| 2.3.2 高通量测序相关质控结果 |
| 2.3.3 差异表达基因的识别 |
| 2.3.4 非刺激条件下不同感染状态结核病牛PBMCs差异表达基因的筛选与分析 |
| 2.3.5 PPD-B刺激条件下不同感染状态结核病牛PBMCs差异表达基因的筛选与分析 |
| 2.4 小结与讨论 |
| 第三章 牛结核病分子标志物的筛选及验证 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 主要试剂与耗材 |
| 3.1.2 主要设备和仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 牛结核病分子标志物的筛选 |
| 3.2.2 牛结核病分子标志物的扩群验证 |
| 3.2.3 统计分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 牛结核病分子标志物的筛选 |
| 3.3.2 牛结核病分子标志物的扩群验证 |
| 3.4 小结与讨论 |
| 第四章 牛分枝杆菌感染BALB/c鼠模型的建立及分子标志物的验证 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 主要试剂耗材 |
| 4.1.3 主要设备和仪器 |
| 4.1.4 主要试剂的配置 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 菌株的复苏与定量 |
| 4.2.2 感染模型的建立 |
| 4.2.3 样品采集及处理 |
| 4.2.4 脏器载菌量测定 |
| 4.2.5 小鼠脾淋巴细胞分离及体外刺激培养 |
| 4.2.6 脾细胞总RNA提取 |
| 4.2.7 反转录 |
| 4.2.8 荧光定量PCR |
| 4.2.9 小鼠IL-8 ELISA |
| 4.2.10 小鼠CRP ELISA |
| 4.2.11 小鼠C1q ELISA |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 体重及主要脏器系数监测 |
| 4.3.2 主要脏器病变及组织病理学观察 |
| 4.3.3 感染小鼠肺、脾的载菌量 |
| 4.3.4 牛结核病分子标志物验证 |
| 4.4 小结与讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（2）牛结核分枝杆菌病感染早期分泌性蛋白MPB 70、MPB 83单克隆抗体的制备及应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1 引言 |
| 1.1 结核分枝杆菌的概述 |
| 1.2 牛结核病的危害 |
| 1.4 牛结核病的临床特征 |
| 1.4.1 肺结核 |
| 1.4.2 乳房结核 |
| 1.4.3 肠结核 |
| 1.4.4 淋巴结核 |
| 1.5 牛结核病的传播 |
| 1.6 牛结核病的预防 |
| 1.6.1 预防方法 |
| 1.6.2 强化检疫 |
| 1.6.3 控制疫病的传入和传播 |
| 1.6.4 加强消毒 |
| 1.6.5 完善并健全防疫制度 |
| 1.7 牛结核病的诊断方法 |
| 1.7.1 细菌学检验(bacteriological analysis) |
| 1.7.1.1 抗酸染色 |
| 1.7.1.2 金胺O荧光染色(Gold amine o fluorescence staining) |
| 1.7.2 免疫学检验 |
| 1.7.2.1 结核菌素皮内试验(intracutaneous tuberculin tests,TT) |
| 1.7.2.2 干扰素体外释放酶联免疫法 |
| 1.7.2.3 斑点免疫胶体金法(dot immunofiltration assay,DIFA) |
| 1.7.2.4 免疫色谱法 |
| 1.7.3 分子生物学检验 |
| 1.7.3.1 DNA探针技术(DNA probe technology) |
| 1.7.3.2 Xpert MTB/RIF检测 |
| 1.7.3.3 重组酶聚合酶扩增技术 |
| 1.7.3.4 聚合酶链反应技术 |
| 1.8 分泌性蛋白MPB 70、MPB 83概述 |
| 1.9 本研究的目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 菌株DNA及载体 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 MPB 70、MPB 83基因的串联表达及抗原性鉴定 |
| 2.2.1.1 MPB 70、MPB 83基因主要抗原域确定 |
| 2.2.1.2 SOE-PCR技术融合 |
| 2.2.1.3 重组原核表达质粒的构建及酶切鉴定 |
| 2.2.1.4 重组基因工程菌的诱导表达、纯化及Westernblot鉴定 |
| 2.2.1.5 MPB 70+ MPB 83融合蛋白小鼠免疫试验 |
| 2.2.2 MPB 70、MPB 83单克隆抗体的制备 |
| 2.2.2.1 免疫原的制备 |
| 2.2.2.2 细胞融合 |
| 2.2.2.3 小鼠腹水的制备 |
| 2.2.2.4 单抗的纯化 |
| 2.2.2.5 腹水MAb鉴定 |
| 2.2.3 牛结核分枝杆菌免疫试纸条的制备 |
| 2.2.3.1 胶体金的制备 |
| 2.2.3.2 灵敏度、特异性检测 |
| 3 试验结果与分析 |
| 3.1 MPB 70、MPB 83基因的串联表达及抗原性鉴定 |
| 3.1.1 MPB 70、MPB 83主要抗原域确定 |
| 3.1.2 MPB70、MPB83基因扩增及融合PCR扩增结果 |
| 3.1.3 重组原核表达载体构建及鉴定 |
| 3.1.4 重组基因工程菌的诱导表达、纯化及Westernblot鉴定 |
| 3.1.5 MPB 70+MPB 83融合蛋白小鼠免疫结果 |
| 3.2 MPB70、MPB83单克隆抗体的制备 |
| 3.2.1 腹水MAb的鉴定 |
| 3.3 牛结核分枝杆菌免疫试纸条的制备 |
| 3.3.1 胶体金的制备 |
| 3.3.2 金标效果检测 |
| 3.3.3 胶体金试纸特异性分析 |
| 3.3.4 胶体金试纸灵敏度分析 |
| 4 结果讨论 |
| 4.1 牛结核分枝杆菌感染早期标识物可行性探讨 |
| 4.2 柔性多肽是否影响融合蛋白的表达及其抗原性 |
| 4.3 腹水适宜条件的探讨 |
| 4.4 胶体金适宜条件的探讨 |
| 4.5 胶体金试纸条检测方法情况探讨 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（3）我国部分地区牛结核病调查与牛肺外结核病病原分离鉴定及生物学特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| SUMMARY |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 概述 |
| 2 牛结核病病原学 |
| 2.1 病原 |
| 2.2 基因组学 |
| 2.3 进化关系 |
| 2.4 毒力因子 |
| 2.5 抗分枝杆菌感染的作用机制 |
| 3 牛结核病的流行病学、发病学及其诊断 |
| 3.1 牛结核病的流行病学 |
| 3.1.1 传播途径 |
| 3.1.2 牛分枝杆菌的流行病学特征 |
| 3.1.3 家畜中的牛分枝杆菌 |
| 3.1.4 人源牛分枝杆菌 |
| 3.2 肺结核与肺外结核的发病学 |
| 3.3 牛结核病的诊断 |
| 3.3.1 皮内变态反应 |
| 3.3.2 基于血液的试验方法 |
| 4 国内外防控模式 |
| 4.1 牛结核病的防控现状 |
| 4.2 国外发达国家牛结核病的防控模式 |
| 4.2.1 欧盟等发达国家基本策略和主要措施 |
| 4.2.2 英国的牛结核病防控策略 |
| 4.3 我国牛结核病的防控策略 |
| 第二章 2015-2018年我国部分地区牛结核病流行病学调查 |
| 第一节 2015-2018年我国部分地区牛结核病免疫学检测 |
| 1 材料 |
| 1.1 样品 |
| 1.2 主要试剂耗材 |
| 1.2.1 试剂 |
| 1.2.2 耗材 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 现场问卷调查 |
| 2.2 现场采样调查 |
| 2.2.1 比较皮内变态反应(SICCT) |
| 2.2.2 IFN-γ试验 |
| 3 结果和分析 |
| 3.1 现场调查结果 |
| 3.1.1 检疫情况 |
| 3.1.2 症状和剖检情况 |
| 3.2 SICCT检测结果 |
| 3.3 IFN-γ试验检测结果 |
| 3.4 时间分布 |
| 3.5 区间分布 |
| 3.6 群间分布 |
| 3.7 重点省份bTB流行情况 |
| 3.8 禽分枝杆菌等的感染情况 |
| 4 讨论 |
| 4.1 群发性特征 |
| 4.2 流行率 |
| 4.3 区域分布 |
| 4.4 非特异性干扰 |
| 5 结论 |
| 第二节 牛分枝杆菌的分离鉴定 |
| 1 材料 |
| 1.1 病料 |
| 1.2 培养基 |
| 1.2.1 丙酮酸钠培养基 |
| 1.2.2 罗氏培养基 |
| 1.2.3 7H11培养基 |
| 1.2.4 7H9培养基 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 病料的采集 |
| 2.2 病料的处理 |
| 2.3 分枝杆菌的分离培养 |
| 2.4 临床分离株的萋尼氏抗酸染色 |
| 2.5 细菌DNA的提取及浓度测定 |
| 2.6 临床分离株的种属多重PCR鉴定 |
| 2.6.1 引物的合成 |
| 2.6.2 反应体系与程序 |
| 2.6.3 判定标准 |
| 2.7 临床分离株MTBC群内PCR鉴定 |
| 2.7.1 引物合成 |
| 2.7.2 反应体系与程序 |
| 2.7.3 判定标准 |
| 3 结果 |
| 3.1 剖检病变 |
| 3.2 分枝杆菌的分离培养结果 |
| 3.3 临床分离株的萋尼氏抗酸染色观察 |
| 3.4 细菌DNA的提取及其浓度 |
| 3.5 分枝杆菌种属鉴定结果 |
| 3.6 MTBC鉴定结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三章 牛肺外结核的综合诊断与病原分离鉴定 |
| 1 材料 |
| 1.1 试剂和培养基 |
| 1.2 耗材 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 试验牛场背景 |
| 2.2 综合诊断策略 |
| 2.2.1 免疫学检测方法 |
| 2.2.2 剖检 |
| 2.2.3 病料的采集 |
| 2.2.4 奶样和粪便的采集 |
| 2.2.5 病理学诊断 |
| 2.2.6 病原分离培养 |
| 2.2.7 分子生物学鉴定 |
| 2.3 针对性防控措施及效果评价 |
| 2.3.1 针对性防控措施 |
| 2.3.2 防控效果评价 |
| 3 结果 |
| 3.1 免疫学综合检测结果 |
| 3.2 剖检结果 |
| 3.3 病理学诊断结果 |
| 3.3.1 HE染色 |
| 3.3.2 Z-N抗酸染色 |
| 3.4 病原分离鉴定结果 |
| 3.4.1 组织病料分离鉴定结果 |
| 3.4.2 奶样和粪便样品分离鉴定结果 |
| 3.5 综合诊断结果 |
| 3.6 防控效果评价 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第四章 牛肺外结核临床分离株致病性研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物及菌株 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 菌株 |
| 1.2 主要试剂耗材 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 动物分组 |
| 2.2 攻毒程序 |
| 2.3 剖检 |
| 2.4 组织病理学观察 |
| 2.5 靶器官组织匀浆的活菌培养 |
| 3 结果 |
| 3.0 实验兔生理状况 |
| 3.1 剖检结果 |
| 3.2 组织病理学结果 |
| 3.2.1 HE染色 |
| 3.2.2 Z-N抗酸染色 |
| 3.3 组织匀浆活菌培养结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第五章 牛肺外结核分离株基因分型与全基因组测序及系统进化分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株 |
| 1.1.1 分型菌株 |
| 1.1.2 测序菌株 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 MIRU-VNTR |
| 2.1.1 引物的设计合成 |
| 2.1.2 反应体系与程序 |
| 2.1.3 聚类分析 |
| 2.1.4 各位点分辨率的计算 |
| 2.2 全基因组测序与分析 |
| 2.2.1 核酸的提取 |
| 2.2.2 全基因组测序 |
| 2.2.3 标准参考序列和数据分析所用的其他MTBC菌株序列的获得 |
| 3 结果 |
| 3.1 MIRU-VNTR基因分型多态性结果 |
| 3.1.1 检测样品结果重复性和准确性 |
| 3.1.2 不同VNTR位点的基因多态性结果 |
| 3.1.3 牛分枝杆菌VNTR位点的等位基因多态性 |
| 3.1.4 MIRU-VNTR聚类分析结果 |
| 3.2 全基因组测序结果 |
| 3.2.1 测序数据评估结果 |
| 3.2.2 全基因组测序数据的初步分析 |
| 3.2.3 基于WGS-SNP的系统发育分析 |
| 3.2.4 全基因组数据的初步比对分析 |
| 3.3 肺结核和肺外结核差异基因研究 |
| 3.3.1 差异基因的比对分析结果 |
| 3.3.2 差异基因的PCR扩增结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 在读期间发表论文和研究成果等 |
| 导师简介 |
（4）抗结核分枝杆菌脂阿拉伯甘露聚糖荧光抗体的制备（论文提纲范文）
| 缩略语 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 一、结核分枝杆菌LAM多克隆抗体的制备 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 主要试剂及仪器 |
| 1.1.3 结核分枝杆菌LAM动物免疫 |
| 1.1.4 抗体效价测定 |
| 1.1.5 动物心脏采血 |
| 1.2 结果与分析 |
| 1.3 讨论 |
| 二、间接ELISA法检测抗体效价 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 主要试剂及仪器 |
| 2.1.2 酶联免疫吸附法检测血清抗LAM抗体 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.3 讨论 |
| 三、多克隆荧光抗体的制备 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验动物血清 |
| 3.1.2 主要试剂及仪器 |
| 3.1.3 多克隆抗体的纯化 |
| 3.1.4 抗体纯化后的SDS-PAGE验证 |
| 3.1.5 抗体的浓缩与BCA法浓度测定 |
| 3.1.6 抗体的FITC荧光标记 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 抗体的SDS-PAGE分析 |
| 3.2.2 抗体的浓缩与BCA法浓度测定 |
| 3.2.3 荧光抗体含量及F/P测定 |
| 3.3 讨论 |
| 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 综述 结核分枝杆菌脂阿拉伯甘露聚糖研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 作者简历 |
| 致谢 |
（5）副结核分支杆菌MAP0862蛋白的表达及临床应用（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 质粒、菌株及主要试剂 |
| 1.2 副结核分支杆菌基因扩增模板的选取 |
| 1.3 MAP0862基因的克隆 |
| 1.4 重组MAP0862蛋白的表达与鉴定 |
| 1.5 MAP0862蛋白高免血清的制备 |
| 1.6 MAP0862抗体检测ELISA方法的建立 |
| 1.7 MAP0862在临床检测上的应用 |
| 1.7.1 ELISA方法检测牛群中副结核病的感染情况 |
| 1.7.2 皮肤变态反应检测牛群中副结核病的早期感染情况 |
| 1.7.3 IFN-γ释放试验检测牛群中副结核病的早期感染情况 |
| 1.7.4 MAP0862蛋白在副结核病诊断中的应用前景分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 MAP0862基因的克隆和重组质粒构建 |
| 2.2 MAP0862蛋白的表达与鉴定 |
| 2.3 MAP0862间接ELISA检测方法的建立 |
| 2.4 MAP0862蛋白在临床诊断中的应用 |
| 2.4.1 ELISA方法检测牛群中副结核病的感染情况 |
| 2.4.2 皮肤变态反应检测牛群中副结核病的早期感染情况 |
| 2.4.3 IFN-γ释放试验检测牛群中副结核病的早期感染情况 |
| 2.4.4 MAP0862蛋白在副结核诊断中的应用前景分析 |
| 3 讨论与结论 |
（6）水牛结核病诊断方法的建立与评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 文献综述 |
| 1.1 研究问题的由来 |
| 1.2 水牛结核病的流行现状 |
| 1.3 水牛结核病的危害 |
| 1.4 水牛结核病的诊断 |
| 1.4.1 细菌学诊断 |
| 1.4.2 免疫学诊断 |
| 1.4.3 分子生物学诊断 |
| Part 1 水牛结核病比较皮试法的建立与分析 |
| 2 研究的目的与意义 |
| 3 材料与方法 |
| 3.1 研究材料 |
| 3.1.1 主要试剂与耗材 |
| 3.1.2 主要仪器设备 |
| 3.1.3 试验动物 |
| 3.2 研究方法 |
| 3.2.1 BCG的培养与鉴定 |
| 3.2.2 牛结核病阴性牛的筛选 |
| 3.2.3 BCG接种奶水牛 |
| 3.2.4 接种牛转阳状态观察 |
| 3.2.5 水牛皮试法的标准化 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 BCG的培养与鉴定 |
| 4.2 牛结核病阴性牛的筛选 |
| 4.3 BCG接种奶水牛 |
| 4.4 接种牛转阳状态观察 |
| 4.5 水牛皮试法的标准化 |
| 4.5.1 奶牛与水牛皮厚值比较 |
| 4.5.2 不同品种水牛之间差异性分析 |
| 4.5.3 不同年龄水牛之间差异性分析 |
| 4.5.4 BCG接种水牛后的皮试检测 |
| 4.5.5 水牛皮试法诊断标准的初步确定 |
| 5 讨论 |
| Prat 2 抗水牛IFN-γ单克隆抗体与多克隆抗体的制备 |
| 1 目的与意义 |
| 2 研究材料 |
| 2.1 菌种、细胞与实验动物 |
| 2.2 研究所需主要试剂 |
| 2.3 研究所需配制的试剂 |
| 3 研究方法 |
| 3.1 水牛IFN-γ的原核表达与鉴定 |
| 3.1.1 重组BbIFN-γ的诱导表达 |
| 3.1.2 SDS-PAGE蛋白凝胶电泳 |
| 3.1.3 重组蛋白的纯化 |
| 3.1.4 重组蛋白的鉴定 |
| 3.2 重组原核表达水牛IFN-γ生物学活性分析 |
| 3.2.1 抗VSV活性的测定 |
| 3.2.2 抗IBRV活性的测定 |
| 3.3 抗水牛IFN-γ单克隆抗体的制备与鉴定 |
| 3.3.1 小鼠免疫 |
| 3.3.2 建立间接ELISA检测方法 |
| 3.3.3 细胞融合 |
| 3.3.4 单克隆抗体Ig亚型检测 |
| 3.3.5 单克隆抗体的生产 |
| 3.3.6 单克隆抗体的纯化 |
| 3.3.7 抗水牛IFN-γ单克隆抗体的鉴定 |
| 3.4 抗水牛IFN-γ多克隆抗体的制备与鉴定 |
| 3.4.1 多克隆抗体的制备 |
| 3.4.2 多克隆抗体的鉴定 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 水牛IFN-γ的原核表达与鉴定 |
| 4.2 重组原核表达水牛IFN-γ生物学活性分析 |
| 4.3 抗水牛IFN-γ单克隆抗体的制备与鉴定 |
| 4.3.1 小鼠免疫 |
| 4.3.2 细胞融合 |
| 4.3.3 抗水牛IFN-γ单克隆抗体的制备与鉴定 |
| 4.3.4 抗水牛IFN-γ多克隆抗体的制备与鉴定 |
| 5 讨论 |
| 5.1 动物免疫 |
| 5.2 细胞融合 |
| 5.3 IgM亚型抗体的纯化 |
| 5.4 单克隆抗体的改造 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 附录 1 ：2017年湖北荆门某水牛场免疫前水牛皮试检测结果(单位：mm) |
| 附录 2 ：免疫60天后水牛皮试检测结果(单位：mm) |
| 附录 3 ：免疫120天后水牛皮试检测结果(单位：mm) |
| 附录 4 ：奶牛皮试结果(单位mm) |
（7）结核分枝杆菌RD区诊断标识抗原的筛选及卡介苗突变体库的构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略表(Abbreviation) |
| 1 文献综述 |
| 1.1 结核病的概述 |
| 1.1.1 结核病的流行及危害 |
| 1.1.2 结核病的类型 |
| 1.2 结核病的病原学 |
| 1.2.1 结核分枝杆菌 |
| 1.2.2 牛分枝杆菌 |
| 1.2.3 其他 |
| 1.3 结核病的诊断 |
| 1.3.1 影像学诊断 |
| 1.3.2 细菌学检测 |
| 1.3.3 分子生物学检测 |
| 1.3.4 免疫学检测 |
| 1.4 机体抗结核免疫 |
| 1.4.1 T细胞介导的免疫应答 |
| 1.4.2 B细胞介导的免疫反应 |
| 1.5 结核疫苗的研究进展 |
| 1.5.1 卡介苗免疫 |
| 1.5.2 结核疫苗在临床中的应用 |
| 1.6 生物膜研究进展 |
| 1.6.1 生物膜的形成 |
| 1.6.2 分枝杆菌生物膜 |
| 1.6.3 生物膜相关的疫苗 |
| 1.7 目的与意义 |
| 2 结核分枝杆菌RD区诊断标识的筛选及其应用 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 菌种与载体 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 培养基与抗生素配制 |
| 2.2.4 主要缓冲液与相关试剂配制 |
| 2.2.5 主要仪器 |
| 2.2.6 引物设计与合成 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 重组质粒的构建 |
| 2.3.2 目的基因的原核表达与纯化 |
| 2.3.3 临床样本的收集 |
| 2.3.4 RD区蛋白的初步筛选 |
| 2.3.5 候选蛋白的复筛 |
| 2.3.6 潜在抗原反应原性的验证 |
| 2.3.7 统计学分析方法 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 RD区基因的克隆 |
| 2.4.2 重组质粒的构建 |
| 2.4.3 RD区基因的原核表达与纯化 |
| 2.4.4 临床样本的收集 |
| 2.4.5 蛋白的初步筛选 |
| 2.4.6 潜在蛋白在临床血清中的验证 |
| 2.4.7 Rv0222与Rv3403c蛋白的westernblotting分析 |
| 2.4.8 Rv0222与Rv3403c蛋白的敏感性与特异性分析 |
| 2.4.9 不同蛋白的联合诊断分析 |
| 2.5 讨论 |
| 2.5.1 RD区蛋白的表达与纯化 |
| 2.5.2 初筛所用标准血清的确定 |
| 2.5.3 潜在抗原的筛选 |
| 2.5.4 Rv0222与Rv3403c抗原的诊断特性 |
| 2.5.5 抗原联合的诊断特性 |
| 3.Rv0222与Rv3403c蛋白免疫原性的研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 菌株 |
| 3.2.2 主要材料、试剂及试剂盒 |
| 3.2.3 培养基的配制 |
| 3.2.4 主要缓冲液 |
| 3.2.5 实验动物 |
| 3.2.6 主要仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 对Rv0222与Rv3403c抗原T细胞表位进行预测 |
| 3.3.2 Rv0222与Rv3403c蛋白的表达、纯化 |
| 3.3.3 Rv0222与Rv3403c蛋白内毒素的去除 |
| 3.3.4 Rv0222与Rv3403c蛋白诱导小鼠的免疫反应 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 对Rv0222与Rv3403c抗原的T细胞表位进行预测 |
| 3.4.2 蛋白的表达纯化及内毒素的测定 |
| 3.4.3 蛋白引起的体液免疫反应 |
| 3.4.4 蛋白引起的细胞免疫的反应 |
| 3.5 讨论 |
| 3.5.1 T细胞表位的预测 |
| 3.5.2 蛋白内毒素的去除 |
| 3.5.3 蛋白诱导的免疫反应 |
| 4 卡介苗突变体库的构建及其在生物膜相关基因筛选中的初步应用 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 菌株与细胞 |
| 4.2.2 主要材料与试剂 |
| 4.2.3 培养基及抗生素的配制 |
| 4.2.4 其他缓冲液的配置 |
| 4.2.5 主要仪器 |
| 4.2.6 引物的设计与合成 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 卡介苗的随机插入突变体库的构建 |
| 4.3.2 成膜突变株的筛选 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 BCG随机突变体库的构建 |
| 4.4.2 BCG突变体成膜能力的初步筛选 |
| 4.5 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 发表文章 |
（8）副结核分枝杆菌分离及小鼠感染模型的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 副结核分枝杆菌与副结核病简介 |
| 1.1.1 副结核分枝杆菌 |
| 1.1.2 副结核病症状及危害 |
| 1.2 副结核病检测诊断方法 |
| 1.2.1 细菌学检测 |
| 1.2.2 血清学检测 |
| 1.2.3 细胞免疫介导试验 |
| 1.2.4 其他检测方法 |
| 1.3 本研究目的和意义 |
| 第二章 牛副结核病流行病学调查 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料 |
| 2.2.1 主要试剂及耗材 |
| 2.2.2 主要仪器、设备 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 皮肤延迟变态反应试验(SDTH) |
| 2.3.2 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
| 2.3.3 PCR方法检测 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 SDTH阳性率 |
| 2.4.2 ELISA抗体阳性率 |
| 2.4.3 PCR方法检测结果 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 副结核分枝杆菌的分离及鉴定 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料 |
| 3.2.1 主要试剂及耗材 |
| 3.2.2 主要仪器、设备 |
| 3.3 方法 |
| 3.3.1 副结核培养基制备 |
| 3.3.2 副结核分枝杆菌分离 |
| 3.3.3 抗酸染色与病理切片制作 |
| 3.3.4 副结核分枝杆菌基因组提取 |
| 3.3.5 副结核分枝杆菌PCR鉴定及分型 |
| 3.3.6 副结核补体结合实验(CFT) |
| 3.3.7 人工感染副结核阳性血清与自然感染血清效价ELISA比较 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 分离得到副结核分枝杆菌 |
| 3.4.2 抗酸染色与病理切片 |
| 3.4.3 IS900特异性片段PCR验证 |
| 3.4.4 IS1311特异性片段验证及分型 |
| 3.4.5 补体结合试验 |
| 3.4.6 人工感染血清与自然感染血清ELISA抗体效价比较 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 副结核分枝杆菌小鼠感染模型建立 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验动物及菌株 |
| 4.2.2 主要试剂、耗材 |
| 4.2.3 主要仪器、设备 |
| 4.3 方法 |
| 4.3.1 菌种复苏及培养 |
| 4.3.2 细菌量及活性的测定 |
| 4.3.3 动物感染 |
| 4.3.4 感染小鼠剖检 |
| 4.3.5 感染小鼠外周血RNA提取 |
| 4.3.6 感染小鼠血清收集 |
| 4.3.7 副结核分枝杆菌抗体ELISA检测板制备 |
| 4.3.8 感染血清抗体ELISA测定 |
| 4.3.9 cDNA文库构建 |
| 4.3.10 引物设计 |
| 4.3.11 引物特异性检测 |
| 4.3.12 qRT-PCR检测细胞因子 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 血清中抗体ELISA检测 |
| 4.4.2 小鼠外周血中不同细胞因子转录水平差异 |
| 4.5 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 5.1 实验结论 |
| 5.2 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（9）猕猴IFN-γ基因的克隆表达及其检测方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表(Abbreviation) |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 结核病的流行及其危害 |
| 1.2 猕猴结核病的流行现状及其危害 |
| 1.3 猕猴结核病的主要诊断方法 |
| 1.3.1 X-光胸透 |
| 1.3.2 细菌学检测方法 |
| 1.3.3 提纯结核菌素(PPD)皮肤试验 |
| 1.3.4 血清学诊断方法 |
| 1.3.5 分子生物学检测方法 |
| 1.3.6 IFN-γ释放法 |
| 1.4 展望 |
| 第2章 MmIFN-γ基因的克隆、原核表达和酵母表达 |
| 2.1 研究的目的意义 |
| 2.2 材料 |
| 2.2.1 菌株以及质粒 |
| 2.2.2 主要药品以及相关试剂 |
| 2.2.3 大肠杆菌培养基的配制 |
| 2.2.4 毕赤酵母培养基的配制 |
| 2.2.5 SDS-PAGE相关溶液的配制 |
| 2.2.6 Western blot缓冲液的配制 |
| 2.2.7 HIS标签融合重组蛋白纯化缓冲液的配制 |
| 2.2.8 其他试剂的配制 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 MmIFN-γ基因原核表达载体的构建 |
| 2.3.1.1 MmIFN-γ基因的引物设计及PCR |
| 2.3.1.2 PCR产物的回收 |
| 2.3.1.3 重组质粒pET-30a-MmIFN-γ的构建 |
| 2.3.1.4 连接产物转化入大肠杆菌 |
| 2.3.1.5 重组质粒的小量制备 |
| 2.3.1.6 重组质粒pET-30a-MmIFN-γ的酶切鉴定 |
| 2.3.2 MmIFN-γ基因的原核表达以及鉴定 |
| 2.3.2.1 IPTG诱导表达 |
| 2.3.2.2 重组蛋白MmIFN-γ的纯化 |
| 2.3.2.3 重组蛋白MmIFN-γ的Western blot鉴定 |
| 2.3.3 MmIFN-γ基因酵母表达载体的构建 |
| 2.3.3.1 MmIFN-γ基因的引物设计及PCR |
| 2.3.3.2 重组质粒pPICZαA-MmIFN-γ的构建 |
| 2.3.3.3 连接产物转化入大肠杆菌 |
| 2.3.3.4 质粒的提取 |
| 2.3.3.5 重组质粒pPICZαA-MmIFN-γ的酶切鉴定 |
| 2.3.4 MmIFN-γ基因的酵母表达以及鉴定 |
| 2.3.4.1 重组质粒的线性化 |
| 2.3.4.2 毕赤酵母感受态细胞的制备 |
| 2.3.4.3 质粒的电转化 |
| 2.3.4.4 重组酵母的PCR鉴定(PCR) |
| 2.3.4.5 甲醇诱导重组酵母表达蛋白 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 MmIFN-γ基因的克隆以及鉴定 |
| 2.4.2 重组MmIFN-γ的原核表达 |
| 2.4.2.1 SDS-PAGE检测原核表达的MmIFN-γ |
| 2.4.2.2 Western blot分析原核表达的MmIFN-γ |
| 2.4.3 重组MmIFN-γ的酵母表达 |
| 2.4.3.1 重组酵母菌的鉴定 |
| 2.4.3.2 重组酵母菌MmIFN-γ的表达分析 |
| 2.4.3.3 Western blot分析真核表达的MmIFN-γ |
| 2.5 讨论 |
| 2.5.1 重组MmIFN-γ表达系统的选择 |
| 2.5.2 重组MmIFN-γ蛋白的纯化 |
| 第3章 MmIFN-γ单克隆抗体与多克隆抗体的制备 |
| 3.1 研究的目的意义 |
| 3.2 材料 |
| 3.2.1 细胞株与实验动物 |
| 3.2.2 主要试剂 |
| 3.2.3 溶液和培养基的配制 |
| 3.2.3.1 制备单克隆抗体相关溶液和培养基的配制 |
| 3.2.3.2 ELISA主要溶液的配制 |
| 3.2.3.3 抗体纯化相关溶液的配制 |
| 3.3 方法 |
| 3.3.1 抗MmIFN-γ单克隆抗体的制备 |
| 3.3.1.1 小鼠免疫 |
| 3.3.1.2 MmIFN-γ抗体的间接ELISA检测方法的建立 |
| 3.3.1.3 细胞融合 |
| 3.3.1.4 杂交瘤细胞阳性孔的筛选 |
| 3.3.1.5 杂交瘤细胞的克隆 |
| 3.3.1.6 单克隆抗体的制备 |
| 3.3.1.7 单克隆抗体的纯化 |
| 3.3.1.8 杂交痈细胞的冻存以及复苏 |
| 3.3.2 抗MmIFN-γ单克隆抗体的鉴定 |
| 3.3.2.1 腹水效价的测定 |
| 3.3.2.2 杂交瘤细胞染色体数的计数 |
| 3.3.2.3 单克隆抗体抗原识别表位的鉴定 |
| 3.3.2.4 单克隆抗体亚型的鉴定 |
| 3.3.2.5 单克隆抗体相对亲和力的检测 |
| 3.3.2.6 单克隆抗体和酵母表达MmIFN-γ反应性的测定 |
| 3.3.3 MmIFN-γ多克隆抗体的制备 |
| 3.3.3.1 MmIFN-γ免疫日本大耳白兔 |
| 3.3.3.2 大耳白兔血清效价的测定 |
| 3.3.3.3 多克隆抗体的纯化及效价的测定 |
| 3.3.3.4 多抗捕获MmIFN-γ检测各株单克隆抗体的反应性 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 免疫小鼠融合前和兔采血前的血清效价 |
| 3.4.2 细胞融合 |
| 3.4.3 杂交痈细胞的筛选及克隆 |
| 3.4.4 腹水效价的测定结果 |
| 3.4.5 杂交痛细胞染色体的计数结果 |
| 3.4.6 单克隆抗体抗原识别表位的鉴定 |
| 3.4.7 单克隆抗体的亚型以及相对亲和力的测定 |
| 3.4.8 单克隆抗体和酵母表达MmIFN-γ反应性的测定 |
| 3.4.9 抗体的纯化和多抗效价的测定 |
| 3.5 讨论 |
| 3.5.1 免疫原 |
| 3.5.2 实验动物的选择和免疫方法 |
| 3.5.3 细胞融合 |
| 3.5.4 筛选杂交瘤细胞的方法选择 |
| 3.5.5 杂交痈细胞的克隆化 |
| 第4章 MmIFN-γ间接双夹心ELISA方法的建立 |
| 4.1 研究的目的意义 |
| 4.2 材料 |
| 4.2.1 主要试剂和材料 |
| 4.3 方法 |
| 4.3.1 单抗和多抗最佳工作浓度的确定 |
| 4.3.2 单克隆抗体检测MmIFN-γ敏感度的测定 |
| 4.3.3 MmIFN-γ间接双夹心ELISA方法的建立及临床样本的检测 |
| 4.3.4 各株单克隆抗体对天然MmIFN-γ的检测 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 单抗和多抗最佳工作浓度的确定 |
| 4.4.2 不同单克隆抗体检测MmIFN-γ敏感度确定 |
| 4.4.3 各株单克隆抗体对天然MmIFN-γ的检测 |
| 4.4.4 MmIFN-γ间接双夹心ELISA方法的建立及临床样本的检测 |
| 4.5 讨论 |
| 4.5.1 单克隆抗体的选择 |
| 4.5.2 称猴结核病IFN-Y检测方法的应用和展望 |
| 4.5.3 基于细胞免疫进行结核病诊断的展望 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（10）水牛IFN-γ克隆表达及其单克隆抗体的制备与应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 干扰素简介 |
| 1.2 结核病的流行及危害 |
| 1.2.1 发病机理 |
| 1.2.2 牛结核的流行现状及危害 |
| 1.2.3 家畜与人之间结核病的关系 |
| 1.3 水牛 |
| 1.3.1 我国水牛发展概况 |
| 1.3.2 水牛结核流行现状 |
| 1.3.3 水牛结核诊断方法 |
| 1.3.3.1 细菌学检查法 |
| 1.3.3.2 提纯结核菌素(PPD)皮内变态反应实验 |
| 1.3.3.3 血清学检测(ELISA诊断)方法 |
| 1.3.3.4 分子生物学方法 |
| 1.3.3.5 抗原特异性IFN-γ检测法 |
| 1.3.4 展望 |
| 第2章 水牛IFN-γ的克隆、原核与酵母表达及生物活性分析 |
| 2.1 研究的目的意义 |
| 2.2 材料 |
| 2.2.1 质粒及菌株 |
| 2.2.2 细胞与病毒 |
| 2.2.3 主要药品与相关试剂 |
| 2.2.4 大肠杆菌主要培养基 |
| 2.2.5 酵母主要培养基 |
| 2.2.5.1 贮存液 |
| 2.2.5.2 酵母培养基 |
| 2.2.6 MDBK细胞培养基 |
| 2.2.7 SDS-PAGE相关溶液的配制 |
| 2.2.8 Western blot缓冲液 |
| 2.2.9 His-tag重组蛋白纯化的溶液 |
| 2.2.10 其他试剂的配置 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 水牛IFN-γ基因的克隆 |
| 2.3.1.1 水牛外周血的培养、淋巴细胞的分离及总RNA的提取 |
| 2.3.1.2 RT-PCR的引物设计及RT-PCR |
| 2.3.1.3 PCR产物的回收与纯化 |
| 2.3.1.4 重组质粒pET-30a-BbIFN-γ和pPICZαA-BbIFN-γ的构建 |
| 2.3.1.5 连接产物或质粒的转化 |
| 2.3.1.6 质粒的提取 |
| 2.3.1.7 重组质粒的鉴定 |
| 2.3.2 水牛IFN-γ的原核表达与鉴定 |
| 2.3.2.1 IPTG诱导表达 |
| 2.3.2.2 重组蛋白可溶或不溶性表达的分析 |
| 2.3.2.3 SDS-PAGE蛋白凝胶电泳 |
| 2.3.2.4 重组可溶性蛋白的纯化 |
| 2.3.2.5 重组蛋白的Western blot鉴定 |
| 2.3.3 水牛IFN-γ的酵母表达 |
| 2.3.3.1 重组质粒pPICZαA-BbIFN-γ转化感受态毕赤酵母 |
| 2.3.3.2 重组酵母的PCR鉴定 |
| 2.3.3.3 多拷贝插入重组子的筛选 |
| 2.3.3.4 重组酵母菌的诱导表达 |
| 2.3.4 水牛IFN-γ密码子的优化、酵母的高效表达 |
| 2.3.4.1 水牛IFN-γ密码子的优化 |
| 2.3.4.2 水牛IFN-γ优化序列的亚克隆 |
| 2.3.4.3 水牛IFN-γ优化序列的酵母表达 |
| 2.3.4.4 重组蛋白的Western blot鉴定 |
| 2.3.5 重组BbIFN-γ生物活性分析 |
| 2.3.5.1 重组原核表达蛋白BbIFN-γ抗VSV和IBRV活性的测定 |
| 2.3.5.2 重组酵母表达蛋白BbIFN-γ抗VSV和IBRV活性的测定 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 水牛IFN-γ信号肽的预测 |
| 2.4.2 水牛IFN-γ基因的克隆与鉴定 |
| 2.4.3 重组BbIFN-γ的原核表达 |
| 2.4.3.1 SDS-PAGE检测原核表达的BbIFN-γ |
| 2.4.3.2 Western blot分析 |
| 2.4.4 重组原核表达蛋白BbIFN-γ抗病毒活性的测定 |
| 2.4.4.1 抗VSV活性的测定 |
| 2.4.4.2 抗IBRV活性的测定 |
| 2.4.5 重组BbIFN-γ的酵母表达 |
| 2.4.6 重组IFN-γ优化序列的酵母高效表达 |
| 2.4.6.1 重组质粒pPICZαA-BbIFN-γ(优)的线性化 |
| 2.4.6.2 重组酵母菌株的筛选 |
| 2.4.6.3 重组酵母菌的可表达性分析 |
| 2.4.6.4 多拷贝插入重组子的筛选 |
| 2.4.6.5 多拷贝重组酵母菌的诱导表达 |
| 2.4.6.6 Western blot分析 |
| 2.4.7 重组酵母表达蛋白BbIFN-γ抗病毒活性的测定 |
| 2.4.7.1 抗VSV活性的测定 |
| 2.4.7.2 抗IBRV活性的测定 |
| 2.5 讨论 |
| 2.5.1 RNA的提取 |
| 2.5.2 序列的测序 |
| 2.5.3 原核表达和毕赤酵母表达 |
| 2.5.4 蛋白纯化 |
| 2.5.5 抗病毒活性试验 |
| 第3章 抗BbIFN-γ单克隆抗体和多克隆抗体的制备 |
| 3.1 研究的目的意义 |
| 3.2 材料 |
| 3.2.1 细胞和实验动物 |
| 3.2.2 主要试剂 |
| 3.2.3 有关溶液的配制 |
| 3.2.3.1 制备单克隆抗体的有关溶液的配制 |
| 3.2.3.2 ELISA主要溶液的配制 |
| 3.2.3.3 抗体纯化的有关溶液的配制 |
| 3.3 方法 |
| 3.3.1 抗BbIFN-γ单克隆抗体的制备 |
| 3.3.1.1 小鼠免疫 |
| 3.3.1.2 间接ELISA检测方法的建立 |
| 3.3.1.3 细胞融合 |
| 3.3.1.4 杂交瘤细胞的筛选 |
| 3.3.1.5 杂交瘤细胞的克隆(有限稀释法) |
| 3.3.1.6 杂交瘤细胞的冻存与复苏 |
| 3.3.1.7 单克隆抗体的生产 |
| 3.3.1.8 腹水中单克隆抗体的纯化(辛酸--硫酸铵法) |
| 3.3.2 抗BbIFN-γ单克隆抗体的鉴定 |
| 3.3.2.1 单克隆抗体(腹水)的效价的测定 |
| 3.3.2.2 杂交瘤细胞染色体计数 |
| 3.3.2.3 单克隆抗体亚型的测定 |
| 3.3.2.4 单克隆抗体相对亲和力的测定 |
| 3.3.2.5 单克隆抗体的特异性及结合活性的鉴定 |
| 3.3.3 抗BbIFN-γ多克隆抗体的制备 |
| 3.3.3.1 日本大耳白兔的免疫 |
| 3.3.3.2 抗体效价的检测 |
| 3.3.3.3 多克隆抗体的纯化(辛酸--硫酸铵法) |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 免疫小鼠和白兔的血清效价 |
| 3.4.2 细胞融合 |
| 3.4.3 杂交瘤细胞筛选及克隆结果 |
| 3.4.4 单克隆抗体(腹水)的效价 |
| 3.4.5 杂交痈细胞染色体计数 |
| 3.4.6 单克隆抗体的亚型及相对亲和力的测定 |
| 3.4.7 单克隆抗体的特异性及结合活性的鉴定 |
| 3.4.8 抗体的纯化 |
| 3.5 讨论 |
| 3.5.1 免疫原 |
| 3.5.2 动物免疫 |
| 3.5.3 细胞融合 |
| 3.5.4 阳性杂交瘤细胞的筛选 |
| 3.5.5 杂交瘤细胞的亚克隆 |
| 3.5.6 杂交瘤细胞的冻存与复苏 |
| 第4章 水牛IFN-γ双抗体夹心ELISA方法的建立 |
| 4.1 研究的目的意义 |
| 4.2 材料 |
| 4.2.1 主要试剂及材料 |
| 4.2.2 ELISA相关溶液的配制 |
| 4.3 方法 |
| 4.3.1 单抗最适包被浓度和夹心抗体最适工作浓度的确定 |
| 4.3.2 水牛IFN-γ单克隆抗体敏感度的确定 |
| 4.3.3 水牛IFN-γ双抗体夹心ELISA方法的建立 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 单抗最适包被浓度和夹心抗体最适工作浓度的确定 |
| 4.4.2 水牛IFN-γ单克隆抗体敏感度 |
| 4.5 讨论 |
| 4.5.1 关于单克隆抗体的选择 |
| 4.5.2 单抗和多抗工作浓度的确定 |
| 4.5.3 水牛结核病IFN-γ检测方法 |
| 第5章 结论 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
四、不同保存方法对结核菌素效价的影响（论文参考文献）
- [1]基于RNA-Seq技术的牛结核病分子标志物的筛选和验证[D]. 房立春. 中国农业科学院, 2020
- [2]牛结核分枝杆菌病感染早期分泌性蛋白MPB 70、MPB 83单克隆抗体的制备及应用[D]. 叶俊. 内蒙古民族大学, 2020(02)
- [3]我国部分地区牛结核病调查与牛肺外结核病病原分离鉴定及生物学特性研究[D]. 许芳. 甘肃农业大学, 2020(01)
- [4]抗结核分枝杆菌脂阿拉伯甘露聚糖荧光抗体的制备[D]. 柏极. 海南医学院, 2020(01)
- [5]副结核分支杆菌MAP0862蛋白的表达及临床应用[J]. 解晓莉,孙阳阳,程凯慧,楚会萌,张亮,王基隆,杨美,杨宏军. 山东农业科学, 2019(02)
- [6]水牛结核病诊断方法的建立与评价[D]. 王子健. 华中农业大学, 2018(01)
- [7]结核分枝杆菌RD区诊断标识抗原的筛选及卡介苗突变体库的构建[D]. 任宁宁. 华中农业大学, 2018(01)
- [8]副结核分枝杆菌分离及小鼠感染模型的建立[D]. 彭永. 中国兽医药品监察所, 2018(08)
- [9]猕猴IFN-γ基因的克隆表达及其检测方法的建立[D]. 姜勇. 华中农业大学, 2012(02)
- [10]水牛IFN-γ克隆表达及其单克隆抗体的制备与应用[D]. 邹新峰. 华中农业大学, 2011(05)