玉米黑粉菌CYP51基因表达及定点突变研究

论文摘要

玉米黑粉病是影响玉米产量和品质的主要病害,广泛发生在世界各玉米产区。每年玉米黑粉病的爆发给农业造成巨大的经济损失。甾醇14α-去甲基化酶（CYP51）是唯一发现普遍存在于所有生物的细胞色素P450家族的一个蛋白质的成员。它是麦角甾醇生物合成过程中的一个关键酶。该酶的缺乏将导致细胞膜的结构破坏和功能的丧失,最终导致真菌死亡。DMIs类杀菌剂是目前农业生产中主要使用的一类抗真菌剂,它通过抑制真菌CYP51而发挥杀菌抑菌的作用。本研究以玉米黑粉菌（Ustilago maydis）为研究对象,结合分子克隆技术和定点突变技术,从两方面研究了重组玉米黑粉菌CYP51的结构与功能的关系。研究结果如下:1.重组玉米黑粉菌CYP51的高效表达。研究表明,去除N端跨膜区对YHCYP51表达至关重要。不管采用哪种载体（pET-28a、pET-32a及pGEX-KG）和宿主菌（BL21（DE3）、BL21（DE3）pLysS及Rosetta（DE3））,全长YHCYP51在E.coli中均不表达。通过生物信息学手段分析CYP51基因结构,重新设计两对分别去除编码N端的不同跨膜区氨基酸残基的CYP51引物（分别去除20和35个氨基酸）。改造了原有的未能表达的重组质粒pET28-YH,构建了重组质粒pET28-YH-20和pET28-YH-35,同时更换两种载体构建了另外四种不同的重组表达质粒。选用不同宿主菌诱导表达六种重组质粒并进行表达条件的优化。SDS-PAGE分析结果表明:仅有pET32-YH-35能够在E.coli BL21（DE3）中高效表达（30℃,0.5mmol/LIPTG诱导）,且能够保持CO结合活性。通过与戊唑醇等四种商品化杀菌剂和25种XF（16种）及ZST（9种）系列合成杀菌剂的结合光谱和结合常数,分析表明:XF-113和ZST-4两种化合物的结合常数接近商品化杀菌剂,有可能开发成为新的杀真菌剂。高效表达的重组YHCYP51蛋白在变性条件下经Ni-NTA亲和层析柱纯化,SDS-PAGE分析表明,纯化的目的蛋白为单一谱带。同时构建了真核表达质粒pAUR123-YH,采用醋酸锂转化后筛选阳性转化子进行真核表达,SDS-PAGE电泳表明在66kD处出现特异表达条带。2.重组玉米黑粉菌CYP51活性部位的结构与功能分析。由于蛋白的活性中心氨基酸残基能够影响其与药物的相互作用,分析玉米黑粉菌与多种真菌及结核分枝杆菌CYP51序列的同源性和保守性,选择可能参与杀菌剂结合的残基进行突变。本实验选择了所有生物CYP51中高度保守的Tryr95和His293及真菌中保守的Phe206这三个点进行定点突变。结果表明,Y95、F206两个位点在YHCYP51与戊唑醇的结合中起作用,而H293位点可能与YHCYP51的三维空间结构的维持有关。玉米黑粉菌CYP51的表达与CYP51活性中心特异氨基酸残基突变的研究有助于进一步阐明真菌的抗药性机理,并为设计开发新型高效抗真菌新药提供了理论基础和新的思路。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1.前言
• 1.1 细胞色素P450
• 1.1.1 细胞色素P450概述
• 1.1.2 细胞色素P450的结构特征
• 1.1.3 细胞色素P450与药物代谢
• 1.2 CYP51研究进展
• 1.2.1 概述
• 1.2.2 基因凋节
• 1.2.3 CYP51结构分析及其与功能的关系
• 1.2.3.1 结构解析
• 1.2.3.2 定点突变研究
• 1.3 CYP51 抑制剂研究概况
• 1.3.1 抑菌机制
• 1.3.2 真菌对CYP51抑制剂的抗性
• 2.材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株和质粒
• 2.1.2 化学试剂及抗生素
• 2.1.3 工具酶与其它试剂
• 2.1.4 培养基及常用缓冲液
• 2.1.5 Ni-NTA亲和层析柱
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 玉米黑粉菌CYP51的生物信息学分析预测
• 2.2.2 玉米黑粉菌CYP51基因的扩增
• 2.2.2.1 特异性引物的设计
• 2.2.2.2 基因的PCR扩增
• 2.2.3 DNA限制性内切酶反应
• 2.2.4 DNA片断的回收和连接
• 2.2.5 碱裂解法小量提取质粒DNA
• 2.2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
• 2.2.7 阳性克隆的筛选及重组质粒的鉴定
• 2.2.8 重组蛋白的原核表达及表达产物的SDS-PAGE分析
• 2.2.9 蛋白的定量及重组蛋白中CYP51含量测定
• 2.2.10 重组蛋白同杀菌剂结合光谱的测定
• 2.2.11 Ni-NTA亲和层析柱分离纯化蛋白质
• 2.2.11.1 重组目的蛋白的大量表达
• 2.2.11.2 重组蛋白的分离纯化
• 2.2.12 酿酒酵母感受态细胞的制备和转化
• 2.2.13 菌落PCR鉴定重组酿酒酵母重组子
• 2.2.14 玉米黑粉菌CYP51基因的真核表达
• 2.2.15 玉米黑粉菌CYP51突变体的构建
• 2.2.15.1 突变体引物的设计
• 2.2.15.2 诱导突变基因
• 2.2.15.3 突变质粒选择
• 2.2.15.4 突变质粒转化
• 2.2.16 突变体原核表达
• 2.2.16.1 突变体原核表达分析
• 2.2.16.2 突变体同杀菌剂结合能力分析
• 3.结果与分析
• 3.1 玉米黑粉菌CYP51的生物信息学分析预测
• 3.1.1 CYP51跨膜结构分析
• 3.1.2 CYP51同源模建的构建
• 3.2 玉米黑粉菌CYP51基因的克隆和鉴定
• 3.3 玉米黑粉菌CYP51基因的表达及同杀菌剂结合光谱的测定
• 3.3.1 全长玉米黑粉菌CYP51基因的原核表达及表达条件的优化
• 3.3.2 去除N端跨膜残基的玉米黑粉菌CYP51基因的原核表达
• 3.3.3 玉米黑粉菌CYP51基因的原核表达
• 3.3.4 玉米黑粉菌CYP51表达条件的优化
• 3.3.5 重组玉米黑粉菌CYP51蛋白（YHCYP51）含量测定
• 3.3.6 YHCYP51重组蛋白和同杀菌剂结合光谱的测定
• 3.3.6.1 YHCYP51重组蛋白同商品化杀菌剂的结合光谱
• 3.3.6.2 YHCYP51重组蛋白同XF及ZST系列合成杀菌剂的结合光谱
• 3.4 YHCYP51重组蛋白的分离纯化
• 3.5 玉米黑粉菌CYP51基因的酵母表达
• 3.5.1 玉米黑粉菌CYP51基因真核表达质粒的构建
• 3.5.2 含有CYP51的酿酒酵母重组子鉴定
• 3.5.3 CYP51基因在酿酒酵母中的表达
• 3.6 玉米黑粉菌CYP51突变体构建及表达分析
• 3.6.1 玉米黑粉菌CYP51突变体的构建
• 3.6.2 突变蛋白在E.coli中的表达水平的比较
• 3.6.3 突变体蛋白同杀菌剂结合能力的比较
• 4.讨论
• 参考文献
• 硕士期间发表的论文
• 衷心感谢以下基金资助
• 致谢