论文摘要
背景与目的缺血缺氧性脑损伤（hypoxic-ischemic brain damage，HIBD）是一种高致残、高致死性的常见疾病。HIBD是一个复杂的病理过程，能量代谢障碍、细胞内钙超载、兴奋性氨基酸（excitatory amino acids，EAAs）产生过多和一氧化氮（nitric oxide，NO）蓄积等在级联的细胞毒作用中具有重要作用。这些机制相互关联，相互促进，导致了神经细胞损伤的恶性循环。目前认为，实施神经保护治疗是提高缺血缺氧性脑损伤治疗有效性的根本措施，其作用机制在于通过阻断缺血缺氧（hypoxic-ischemic，HI）所致各类有害变化的病理过程的发生，减轻脑组织的进一步损伤，促进神经功能的恢复。目前，虽然一些西药相继应用于实践，但由于副作用而限制了其临床进一步应用。天然药物由于具有作用机制的多靶点和低毒性的特点，已被广泛用于神经保护药物的研究。因此，缺血缺氧性脑损伤防治药物的开发，对防治脑缺血缺氧性细胞损伤的发生，改善疾病预后具有重要意义。神经保护剂的研制和应用已成为缺血缺氧性脑损伤防治研究的焦点，具有广阔的发展应用前景。天麻素（Gastrodin，Gas）是我国传统中药天麻的主要药用成分，化学名为4-羟甲基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷。药理试验表明：天麻素是一种安全的镇静药，具有镇静、镇痛、改善心脑血管功能及抗炎、抗自由基等作用。其特点是安全低毒，不易产生药物蓄积；无药物依赖性、成瘾性等优点。近年来的研究表明天麻素能够增强血管的顺应性，改善脏器缺氧状态，对一些由脑供血不足造成的中枢神经系统疾病有较好的治疗作用，但其在神经细胞保护方面的作用机理尚缺乏更为深入的研究。本课题拟在已有研究的基础上，以体外培养的大鼠大脑皮层神经细胞为研究对象，造成体外缺血缺氧损伤模型，利用生化及分子生物学技术，旨在探讨天麻素对神经细胞损伤的保护作用及其可能的分子机制，期望为缺血缺氧性脑血管病的防治提供理论基础，具有实用意义。材料与方法1．Wistar大鼠（孕16-19天）大脑皮层神经细胞的原代培养。2．用缺糖和充氮气的方法制备缺血缺氧细胞损伤模型。制备模型时无糖Earle’s液和氮气作用5小时。培养的神经细胞随机分为3组：正常对照组、缺血缺氧损伤组和天麻素组，天麻素组中分别加入13mg／L、26mg／L、52mg／L终浓度的天麻素。3．倒置显微镜下观察细胞形态的改变。4．台盼兰染色法观察细胞的存活率。5．试剂盒测定法检测细胞NO和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）的释放。6．RT-PCR法检测神经细胞NR1 mRNA的表达以及天麻素对其表达的影响。7．使用SPSS10.0软件进行分析。所有数据用（?）±S表示，多组均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD t检验，P＜0.05表明有统计学意义。结果1．天麻素对神经细胞形态学的改变倒置显微镜下活细胞观察：正常对照组细胞胞体丰满，突起较长，连成网状；缺血缺氧损伤组，大部分细胞肿胀，坏死；加入天麻素各组，细胞形态有所改善，较多细胞保留突起结构，肿胀细胞及细胞碎片均明显减少，以26mg／L浓度组细胞形态改善最为明显。2．天麻素对神经细胞存活率的影响台盼兰染色结果显示：神经细胞缺血缺氧损伤后，细胞存活率明显降低，与正常对照组相比有显著性差异（P＜0.01），表明细胞活力明显下降，细胞呈现损伤状态；加入不同浓度（13mg／L、26mg／L、52mg／L）天麻素各组，均可使细胞的存活率显著提高（P均＜0.01），以26mg／L浓度组效果最佳。提示天麻素对损伤的神经细胞有保护作用。3．天麻素对神经细胞培养液中NO含量和LDH活性的影响缺血缺氧损伤组细胞培养液NO水平与正常对照组相比显著升高（P＜0.01）；不同浓度（13mg／L、26mg／L、52mg／L）天麻素各组与损伤组相比，培养液中NO水平显著降低（P＜0.05）。损伤组细胞释放至培养液中的LDH（1788.5±129.2U／L）与正常对照组（874.56±98.18U／L）相比显著性升高（P＜0.01）；加入浓度为13mg／L，26mg／L和52mg／L天麻素可显著降低LDH的漏出，与损伤组相比P＜0.05。4．天麻素对大鼠大脑皮层神经细胞NR1 mRNA表达的影响：采用RT-PCR法对缺血缺氧损伤神经细胞的NR1 mRNA进行检测，结果显示：损伤组细胞NR1 mRaNA的相对表达量（0.901±0.106）与正常对照组（0.146±0.046）相比明显升高，统计学处理有显著性意义（P＜0.01）；不同浓度（13mg／L、26mg／L、52mg／L）天麻素各组均能显著抑制NR1 mRNA的表达（P均＜0.01），各组相对表达量分别为0.659±0.134、0.297±0.046和0.334±0.056，以26mg／L浓度天麻素组抑制作用最强。结论天麻素可明显改善缺血缺氧神经细胞的形态、提高细胞的存活率、减少细胞NO和LDH的释放以及抑制神经细胞NR1 mRNA的表达。其作用机制可能通过抑制神经细胞NR1 mRNA的表达，从而使NR1 mRNA指导合成的N-甲基-D-天冬氨酸（N-Methyl-D-aspartate，NMDA）受体减少，减轻NMDA受体所介导的兴奋性毒性作用，保护细胞膜的完整性，使受损细胞培养液中LDH漏出减少；切断了Glu-NO-cGMP通路，使NO含量降低。上述诸因素共同作用的结果使细胞形态得到改善，细胞存活率提高。