趋化因子受体CXCR4 shRNA真核表达载体的构建及其在真核细胞中的表达

论文摘要

目的:构建趋化因子受体CXCR4的特异RNA干扰载体,并检测CXCR4的特异小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）对人急性单核细胞白血病细胞系（SHI-1）CXCR4 mRNA的影响,为进一步研究该基因功能和以RNA干扰为手段的白血病基因治疗打下基础。方法:根据GenBank数据库提供的CXCR4基因mRNA序列,按照Tusch1设计原则,选择设计siRNA,再转化为能转录短发夹状RNA （ short hairpin RNA, shRNA ）的DNA序列,并与逆转录病毒载体（pRNAT）连接,采用酶切、多聚酶链式反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）和DNA测序方法进行鉴定;阳离子脂质体（Lipofectamine 2000）介导的重组质粒转染包装病毒细胞（PT67）,收集病毒上清感染SHI-1细胞,经G418筛选稳定抑制CXCR4基因表达的SHI-1细胞株,应用RT-PCR检测细胞CXCR4 mRNA表达;并用有限稀释法试行挑取单克隆细胞。结果:构建的真核表达载体,经酶切、PCR和DNA测序证实与设计完全一致。与SHI-1细胞和转染阴性对照质粒细胞相比,转染干扰表达载体的SHI-1细胞CXCR4 mRNA的表达明显降低。结论:CXCR4 shRNA真核表达载体构建成功,并有效干扰SHI-1细胞CXCR4 mRNA的表达。它可作为进一步研究该基因的功能和探索白血病的基因治疗的工具。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 引言
• 第2章 材料和仪器
• 2.1 主要材料
• 2.2 主要仪器
• 第3章 实验方法
• 3.1 细胞培养
• 3.2 目的基因的设计
• 3.3 构建人CXCR4 shRNA 表达载体
• 3.3.1 单链DNA 退火
• 3.3.2 逆转录病毒载体pRNAT 酶切
• 3.3.3 酶切产物纯化
• 3.3.4 连接
• 3.3.5 连接产物转化E.coli DH5α感受态菌种
• 3.3.6 重组质粒提取
• 3.3.7 酶切鉴定
• 3.3.8 PCR 鉴定
• 3.3.9 测序鉴定
• 3.4 重组质粒转染病毒包装细胞株（PT67）
• 3.5 流式细胞仪和荧光显微镜检测转染率
• 3.6 转染后的PT67 细胞的上清液感染SHI-1 细胞
• 3.7 各组SHI-1 细胞CXCR4mRNA 表达量的检测
• 3.7.1 RNA 的提取
• 3.7.2 逆转录合成cDNA
• 3.7.3 PCR 和电泳鉴定
• 3.8 挑选单克隆SI-SHI-1 和NC-SHI-1 细胞
• 3.9 统计学处理
• 第4章 结果
• 4.1 酶切鉴定重组质粒
• 4.2 PCR 鉴定重组质粒
• 4.3 重组质粒序列测定
• 4.4 重组质粒转染率的检测
• 4.5 病毒上清转染SHI-1 细胞转染效率的检测
• 4.6 挑选单克隆细胞
• 4.7 各组SHI-1 细胞CXCR4 mRNA 表达的变化
• 第5章 讨论
• 第6章 结论与展望
• 6.1 结论
• 6.2 进一步工作的方向
• 致谢
• 参考文献
• 附录 A 综述
• 参考文献
• 攻读学位期间的研究成果