兽疫链球菌发酵生产透明质酸过程控制与优化

论文摘要

透明质酸（HA）是由葡萄糖醛酸和乙酰氨基葡萄糖通过β-（1→3）和β-（1→4）糖苷键连接而成的粘多糖,具有高保湿性、粘弹性和生物相容性等许多优良性质,在生物医药、化妆品和保健食品等领域具有广泛应用。目前微生物发酵法已经取代动物组织提取法成为生产HA的主要方法,随着HA市场需求的不断扩大,有效提高发酵法生产HA的产率和生产强度至关重要。本论文依据HA发酵系统的混合与传质特性以及生产菌株兽疫链球菌Streptococcus zooepidemicus自身的生理代谢特性,提出了一系列发酵优化与控制策略,实现了微生物发酵法生产HA的高产量、高底物转化率与高生产强度的相对统一,其主要研究内容和结果如下:（1） HA发酵属于高粘度发酵,混合性能差和传质效率低是HA发酵的一个重要瓶颈,因此优化HA发酵体系的混合与传质特性至关重要。首先研究了HA发酵过程的混合与传质特性,然后运用径向基函数神经网络-具有量子行为的粒子群优化算法（RBF-QPSO）对影响混合与传质特性的三个主要因素（搅拌转速、通气速率与搅拌器个数）进行优化。得到的优化条件为:搅拌转速294 rpm,通气速率1.5 vvm,搅拌器个数3,在此条件下HA产量为5.58 g/L,比优化前提高了12%（以5.0 g/L为对照）;（2）进一步研究发现在上述优化条件下HA发酵体系仍没有处于全混合状态,于是进一步研究了全混合状态对HA发酵的影响。结果表明在全混合状态下虽然混合与传质效率得到明显提高,但是HA产量反而下降,这可能是因为在全混合状态下高搅拌转速（高剪切力）对细胞的剪切作用较大,降低了细胞的生理代谢活性,表明低剪切、高传质效率和高溶氧水平是HA发酵的较理想方式;（3）基于上述研究结果,进一步研究了添加氧载体正十二烷对HA发酵过程的影响,结果表明,当添加的正十二烷浓度为5%（v/v）时,8-16 h期间的平均体积溶氧传递系数（KLa）为37 h-1,是添加前的3.7倍;HA产量达到6.3 g/L,提高了26%;（4）在上述研究基础上进一步探讨了在发酵过程中通过降解HA提高发酵体系混合与传质效率的可能性。考察了在发酵过程中添加透明质酸酶对HA发酵过程的影响,研究结果表明在发酵过程中添加透明质酸酶降解透明质酸能够显著改善发酵体系的混合与传质特性,当添加的透明质酸酶浓度为0.25 g/L时,HA分子量由1300 kDa降为21kDa,发酵体系处于完全混合状态,KLa为100 h-1,HA产量为6.0 g/L,提高了20%;（5）出于对生产成本的考虑,进一步考察了在发酵过程中同时添加过氧化氢和抗坏血酸对HA发酵过程的影响,在发酵8 h和12 h两次添加过氧化氢和抗坏血酸以氧化还原降解HA也能够显著改善发酵体系的混合与传质特性,当添加的过氧化氢浓度为1.0mmol/g HA、抗坏血酸浓度为0.5 mmol/g HA时,KLa从3.7 h-1提高到49 h-1,HA产量为6.5 g/L,提高了26%;（6）基于HA在兽疫链球菌中的生理功能以及细胞在胁迫环境下的物质及能量代谢的应答机理,考察了流加H2O2进行氧化胁迫对HA发酵过程的影响,研究发现在分批培养过程中流加H2O2进行氧化胁迫能够转变细胞产能途径、提高细胞产能效率和提高HA合成速率,当H2O2流加速率为0.06 mmol L-1 h-1时,HA的产量达到6.0 g/L,比对照提高了20%;（7）提出了一种间歇性pH胁迫策略:前0-6 h期间控制pH为7.0,在6-7 h期间控制pH为8.5,在7-8 h期间控制pH为7.0,在8-9 h期间再将pH调到8.5,如此循环下去,直至发酵结束。在此胁迫策略控制下,HA产量提高到6.5 g/L,提高了30%;（8）考察了HA发酵过程中常见氨基酸的代谢动力学,确定精氨酸、半胱氨酸和赖氨酸是影响细胞生长和HA合成的关键氨基酸;考察了添加核苷酸碱基（腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶）对HA发酵过程的影响,发现尿嘧啶对HA发酵具有重要影响。运用RBF-QPSO算法对关键营养因子的添加浓度进行了优化,最佳添加浓度为:精氨酸0.062 g/L,半胱氨酸0.036 g/L,赖氨酸0.043 g/L,尿嘧啶0.06 g/L时,在此条件下,HA产量提高到6.3 g/L,提高了26%;（9）研究了不同培养模式对HA发酵过程的影响,发现采用分批培养可获得较高的碳源对HA的转化率,而补料分批培养可获得较高的细胞比生长速率,于是提出了一种两阶段培养模式:在第一阶段内（0-8 h）进行指数流加培养,在8 h提高碳源浓度至25 g/L,进行第二阶段的分批培养。在此两阶段培养模式中,HA产量提高至5.98 g/L,比单一分批培养模式提高了20%。为进一步提高HA产量,在第二阶段培养期间应用间歇性pH胁迫策略转变细胞产能途径、提高细胞产能效率,HA产量进一步提高至6.6 g/L,提高了32%,碳源对HA的转化率（YHA）提高了19%,而生产强度提高了32%,实现了HA高产量、高底物转化率与高生产强度的相对统一。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 概述
• 1.1.1 医药生物技术与透明质酸
• 1.1.2 透明质酸的结构与分布
• 1.1.3 透明质酸的性质与用途
• 1.2 透明质酸的生产
• 1.2.1 动物组织提取法
• 1.2.2 微生物发酵法
• 1.2.2.1 HA 的微生物合成途径
• 1.2.2.2 HA 的合成与分泌的分子生物学机制
• 1.2.2.3 微生物发酵法生产HA 的国际研究概况
• 1.3 智能计算方法在发酵工程中的应用
• 1.4 本论文主要研究内容
• 1.4.1 微生物发酵法生产HA 研究中仍存在的问题
• 1.4.2 本论文的主要研究内容
• 参考文献
• 第二章 透明质酸发酵过程的混合与传质特性优化研究
• 2.1 前言
• 2.2 发酵系统的混合与传质特性理论
• 2.2.1 发酵系统的流体力学
• 2.2.2 发酵系统的混合特性
• 2.2.3 发酵体系的传质特性
• 2.3 材料与方法
• 2.3.1 菌株
• 2.3.2 培养基
• 2.3.3 培养方法
• 2.3.4 分析方法
• 2.4 结果与讨论
• 2.4.1 HA 分批发酵过程代谢动力学
• 2.4.2 HA 分批发酵混合与传质动力学
• 2.4.3 RSM 与RBF-QPSO 算法优化HA 分批发酵过程
• 2.4.4 添加氧载体正十二烷对S. zooepidemicus 发酵生产HA 的影响
• 2.4.5 HA 发酵系统传质特性的模型化研究
• 2.5 本章小结
• 参考文献
• 第三章 降解透明质酸提高发酵系统的混合与传质效率
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 菌株
• 3.2.2 培养基
• 3.2.3 培养方法
• 3.2.4 分析方法
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 添加透明质酸酶对HA 发酵系统混合与传质特性的影响
• 3.3.2 添加透明质酸酶对HA 发酵代谢动力学的影响
• 3.3.3 氧化还原反应（过氧化氢/抗坏血酸）降解HA 的条件研究
• 3.3.4 添加过氧化氢/抗坏血酸对HA 发酵系统混合与传质特性的影响
• 3.3.5 添加过氧化氢/抗坏血酸对HA 发酵代谢动力学的影响
• 3.4 本章小结
• 参考文献
• 第四章 转变产能途径、提高产能效率优化透明质酸发酵
• 4.1 前言
• 4.2 代谢工程理论
• 4.2.1 代谢通量分析
• 4.2.2 代谢控制分析
• 4.3 材料与方法
• 4.3.1 菌株
• 4.3.2 培养基
• 4.3.3 培养方法
• 4.3.4 分析方法
• 4.4 结果与讨论
• 2O₂ 流加浓度对HA 发酵的影响'>4.4.1 恒化培养体系中H₂O₂ 流加浓度对HA 发酵的影响
• 2O₂ 流加浓度对HA 发酵的影响'>4.4.2 分批培养中H₂O₂ 流加浓度对HA 发酵的影响
• 4.4.3 间歇性pH 胁迫策略对HA 发酵的影响
• 4.5 本章小结
• 第五章 基于细胞生理代谢特性的透明质酸发酵优化研究
• 5.1 前言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 菌株
• 5.2.2 培养基
• 5.2.3 培养方法
• 5.2.4 分析方法
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 HA 发酵过程中氨基酸代谢动力学
• 5.3.2 添加核苷酸碱基对HA 发酵过程的影响
• 5.3.3 添加关键营养因子对HA 发酵过程的影响
• 5.4 本章小结
• 参考文献
• 第六章 透明质酸发酵过程培养模式优化研究
• 6.1 前言
• 6.2 培养模式
• 6.3 材料与方法
• 6.3.1 菌株
• 6.3.2 培养基
• 6.3.3 培养方法
• 6.3.4 分析方法
• 6.4 结果与讨论
• 6.4.1 分批培养代谢动力学
• 6.4.2 补料分批培养对HA 发酵的影响
• 6.5 本章小结
• 参考文献
• 结论
• 论文创新点
• 附录Ⅰ：作者攻读博士学位期间发表主要论文
• 附录Ⅱ：QPSO 算法编码程序
• 致谢