棉花、烟草响应低温胁迫的差异蛋白质组学研究

论文摘要

植物在长期的进化过程中具备了各种不同的生理生化机制,以抵抗、适应各种逆境。在众多非生物胁迫中,低温是限制许多重要作物产量和分布的重要环境因素。植物通过改变形态、生理和生化过程,使胁迫应答基因表达,合成特殊的蛋白质来响应低温胁迫。到目前为止,关于低温胁迫对植物生长发育以及各种代谢活动影响产生的机理还不清楚。本研究利用差异蛋白质组学策略首次对低温胁迫下棉花幼苗、烟草悬浮细胞蛋白质组变化以及外源转录因子CBF1A表达对烟草悬浮细胞蛋白质组的影响进行了研究,以期为揭示植物对低温胁迫响应的分子机制提供依据。1利用差异蛋白质组学策略,采用三氯乙酸-丙酮沉淀法（ TCA/acetone precipitation）提取棉花幼苗总蛋白质,建立了棉花幼苗蛋白质双向电泳体系;双向电泳凝胶经银染和考马斯亮蓝R-350热染,扫描获取电泳图片,利用ImageMaster 2D Platium Software分析比较低温胁迫处理幼苗与未低温处理幼苗的蛋白质组差异;发现银染的凝胶中有54个差异表达蛋白点,其中29个蛋白点在低温处理后表达量升高,25个蛋白点表达量降低;利用质谱技术成功鉴定出其中的8个差异表达蛋白点,其中的7个蛋白点被鉴定为同一种蛋白β-球蛋白,另一种蛋白鉴定为Rubisco大亚基;通过对棉花子叶生理生化指标的测定发现,低温胁迫会引起棉花幼苗子叶肽链内切酶活性的增强;子叶净光合速率和羧化效率降低;棉花子叶内活性氧产生速率升高,脂质过氧化加速。基于上述结果,我们认为低温胁迫会加速β-球蛋白和Rubisco大亚基的降解,并对蛋白的降解模式进行了分析。本文为从分子水平上揭示棉花幼苗低温响应机制研究奠定了基础,为深入了解低温胁迫下蛋白的降解机制提供了依据。2利用差异蛋白质组学策略,采用三氯乙酸-丙酮沉淀法提取烟草悬浮细胞总蛋白质,建立了烟草悬浮细胞蛋白质双向电泳体系;分析比较了烟草悬浮细胞在低温胁迫处理后蛋白质组的变化,通过对差异表达蛋白点的鉴定,发现LEA–类似蛋白NtLEA7-3的丰度在低温处理后上调,为低温诱导表达升高蛋白。通过荧光定量PCR分析发现低温胁迫下该蛋白mRNA水平变化与蛋白表达水平变化情况基本一致。利用RACE技术得到NtLEA7-3基因全长cDNA （GenBank登录号:EF532409）。NtLEA7-3 cDNA全长为1 267 bp,该序列含有一个969 bp的完整开放读码框,编码322个氨基酸,蛋白质理论分子量约为35.7 kDa,等电点为4.86。对NtLEA7-3编码的蛋白质进行结构预测分析表明,该蛋白富含无规卷曲（Coil）,高达65.31%,其次是α-螺旋（Helix）,为19.69 %,而β-折叠（Strand）只有15.00%。将NtLEA7-3编码区插入原核表达载体pET30a （+）,并转化到大肠杆菌菌株BL21中,经IPTG诱导,NtLEA7-3融合蛋白在BL21菌株中成功表达。将得到的NtLEA7-3编码区插入植物表达载体pBI121中,构建了NtLEA7-3植物表达载体pBI121-LEA;成功地将其转入到烟草和悬浮细胞中,获得了转基因烟草植株及悬浮细胞,通过对转基因植株及悬浮细胞的表型和低温胁迫下生理生化特征分析表明,NtLEA7-3成功地表达可以提高转基因植株和悬浮细胞的耐低温胁迫能力。将NtLEA7-3编码区插入含有GFP基因的植物表达载体pBI121中,构建了NtLEA7-3-GFP的植物表达载体pBI121-LEA-GFP,成功地将NtLEA7-3-GFP融合基因转入拟南芥和烟草悬浮细胞,发现NtLEA7-3定位于细胞核中。本文不仅为研究植物的抗逆机理提供了参考,为植物抗性育种提供了有效的候选基因,同时为深入研究NtLEA7-3的结构、功能和分子调控机制奠定了基础。3成功地将棉花低温胁迫相关转录因子CBF1A基因转入了烟草悬浮细胞中,利用差异蛋白质组学策略分析了转CBF1A基因烟草悬浮细胞和野生型烟草悬浮细胞的蛋白质组差异,发现外源CBF1A基因的表达会引起烟草悬浮细胞蛋白质组的变化,有7个蛋白点表达差异显著,其中4个蛋白点表达升高,3个蛋白点表达降低。利用质谱技术成功鉴定出其中6个蛋白点,代表了5种不同的蛋白,其中3个是功能已知蛋白,即推测的叶绿体半胱氨酸合成酶前体、苹果酸脱氢酶类似蛋白、短链脱氢酶,另2个蛋白为功能未知蛋白。本研究为揭示CBF1A对植物的调控机制提供了参考。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章文献综述
• 1 植物低温胁迫响应的分子机理研究进展
• 1.1 植物低温胁迫信号传导
• 1.1.1 Ca2+与低温胁迫信号传导
• 1.1.2 ABA 与植物低温信号传导
• 1.1.3 蛋白激酶途径在低温信号传导中的作用
• 1.1.4 次级信号的传导作用
• 1.2 植物对于低温胁迫响应的调控
• 1.2.1 转录调控
• 1.2.1.1 ICE1-CBF 转录级联
• 1.2.1.2 CBF 调节子的负调节子
• 1.2.1.3 非CBFs 调节子
• 1.2.2 转录后调控
• 1.2.2.1 RNA 的加工和出核运输
• 1.2.2.2 small RNAs 在植物低温响应中发挥重要作用
• 1.2.3 翻译后调控
• 1.3 直接参与植物低温胁迫响应的功能蛋白
• 1.3.1 抗冻蛋白
• 1.3.2 抗渗透胁迫相关蛋白
• 1.3.3 抗膜脂相改变的蛋白
• 1.3.4 植物脱水素
• 1.3.5 热激蛋白
• 1.3.6 抗氧化酶系统
• 1.4 展望
• 2 植物非生物胁迫差异蛋白质组学研究进展
• 2.1 差异蛋白质组学的研究方法
• 2.1.1 双向电泳
• 2.1.2 表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱（SELDI）技术
• 2.1.3 多维色谱分离技术
• 2.1.4 SELDI 蛋白质芯片技术
• 2.1.5 同位素亲和标签质谱技术
• 2.1.6 生物信息学分析
• 2.2 植物非生物胁迫差异蛋白质组学研究进展
• 2.2.1 干旱胁迫
• 2.2.2 盐渍胁迫
• 2.2.3 低温胁迫
• 2.2.4 机械损伤
• 2.2.5 营养胁迫
• 2.2.6 其他非生物胁迫
• 2.2.6.1 缺氧胁迫
• 2.2.6.2 光照胁迫
• 2.2.6.3 植物胁迫信号物质处理
• 2.2.6.4 环境污染
• 2.2.6.5 除草剂胁迫
• 2.3 植物差异蛋白质组学面临的主要问题和展望
• 3 胚胎发育后期丰富蛋白（LEA）的研究进展
• 3.1 LEA 蛋白的特点
• 3.1.1 基元序列和肽谱
• 3.1.2 LEA 蛋白的系统发育
• 3.1.3 LEA 蛋白的表达模式
• 3.1.4 LEA 蛋白的亚细胞定位
• 3.1.5 LEA 蛋白的结构
• 3.1.6 LEA 蛋白生化特性
• 3.2 LEA 蛋白的功能
• 3.2.1 转基因研究
• 3.2.2 稳定蛋白和分子屏障功能
• 3.2.3 离子结合和抗氧化功能
• 3.2.4 对膜的稳定作用
• 3.2.5 其他潜在的功能
• 3.3 展望
• 4 本研究的目的意义
• 第二章 棉花幼苗响应低温胁迫的差异蛋白质组学分析
• 1 材料与方法
• 1.1 植物材料与试剂
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 化学试剂
• 1.2 方法
• 1.2.1 棉花幼苗的培养与低温胁迫处理
• 1.2.2 棉花幼苗子叶蛋白质的提取
• 1.2.3 蛋白质的纯化
• 1.2.4 蛋白质的定量
• 1.2.5 棉花子叶蛋白质的双向电泳
• 1.2.5.1 第一向等电聚焦电泳
• 1.2.5.2 IPG 胶条的平衡
• 1.2.5.3 灌胶
• 1.2.5.4 第二向SDS 电泳
• 1.2.5.5 染色、脱色
• 1.2.6 图象的扫描和分析
• 1.2.7 差异点的胶内酶解
• 1.2.8 MALDI-TOF-MS 质谱分析与数据检索
• 1.2.9 子叶净光合速率的测定
• 1.2.10 棉花幼苗子叶羧化效率的测定
• 1.2.11 肽链内切酶活性的测定
• 1.2.12 活性氧的测定
• 1.2.13 丙二醛含量的测定
• 2 结果与分析
• 2.1 棉花子叶蛋白质的双向电泳分析
• 2.2 差异表达蛋白点的质谱鉴定
• 2.3 低温胁迫对棉花子叶肽链内切酶活性的影响
• 2.4 低温胁迫对棉花子叶净光合速率和羧化效率的影响
• 2.5 低温胁迫对棉花子叶内活性氧产生速率及脂质过氧化的影响
• 3 讨论
• 3.1 低温胁迫加速棉花幼苗储藏蛋白的降解
• 3.2 低温胁迫加速棉花幼苗光合蛋白的降解
• 4 小结
• 第三章 烟草低温响应蛋白—胚胎后期丰富蛋白（NtLEA7-3）的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 载体和菌株
• 1.1.3 试验引物
• 1.1.4 其它材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 烟草悬浮细胞的培养
• 1.2.2 烟草悬浮细胞的低温处理及其生长状况的测定
• 1.2.3 烟草悬浮细胞蛋白质的双向电泳分析
• 1.2.3.1 烟草悬浮细胞蛋白质的提取
• 1.2.3.2 烟草悬浮细胞蛋白质的纯化
• 1.2.3.3 烟草悬浮细胞蛋白质的定量
• 1.2.3.4 烟草悬浮细胞蛋白质的双向电泳
• 1.2.3.5 图象的扫描和分析
• 1.2.4 差异蛋白点的MALDI-TOF/ TOF -MS 质谱鉴定
• 1.2.4.1 差异点的胶内酶解
• 1.2.4.2 差异蛋白点的MALDI-TOF/ TOF -MS 质谱分析
• 1.2.4.3 数据检索
• 1.2.5 烟草悬浮细胞总 RNA 的提取和差异点蛋白基因的荧光定量 PCR
• 1.2.5.1 烟草悬浮细胞总RNA的提取
• 1.2.5.2 cDNA 的合成
• 1.2.5.3 差异表达蛋白点的荧光定量PCR
• 1.2.6 烟草悬浮细胞 NtLEA7-3 基因的克隆
• 1.2.6.1 NtLEA7-3 的 3'RACE
• 1.2.6.2 cDNA 同聚物加尾反应
• 1.2.6.3 NtLEA7-3 的 5'RACE
• 1.2.6.4 NtLEA7-3 cDNA 编码区全长序列的获得
• 1.2.6.5 目的片段的回收
• 1.2.6.6 目的片段与克隆载体的连接
• 1.2.6.7 大肠杆菌DH5α感受态的制备
• 1.2.6.8 大肠杆菌细胞的转化
• 1.2.6.9 质粒 DNA 的提取（小量碱法）
• 1.2.6.10 阳性克隆质粒的鉴定
• 1.2.6.11 序列测定
• 1.2.7 NtLEA7-3 序列分析
• 1.2.8 NtLEA7-3 所编码的蛋白质特性分析
• 1.2.9 NtLEA7-3基因表达载体的构建与鉴定
• 1.2.9.1 目的片段与表达载体的连接
• 1.2.9.2 原核表达载体的构建与鉴定
• 1.2.9.3 NtLEA7-3 融合蛋白诱导表达、纯化与电泳分析
• 1.2.9.4 NtLEA7-3 植物表达载体的构建与鉴定
• 1.2.9.5 NtLEA7-3-GFP 融合基因植物表达载体的构建与鉴定
• 1.2.10 农杆菌GV3101 感受态细胞制备及转化
• 1.2.11 NtLEA7-3 及NtLEA7-3-GFP 基因转化烟草悬浮细胞及阳性转化系的PCR 鉴定
• 1.2.11.1 烟草悬浮细胞的转化
• 1.2.11.2 转基因烟草悬浮细胞的PCR 鉴定
• 1.2.12 NtLEA7-3 基因在烟草中超表达及转基因烟草的PCR 鉴定
• 1.2.12.1 烟草的转化方法
• 1.2.12.2 转基因烟草的PCR 鉴定
• 1.2.13 NtLEA7-3-GFP 融合基因在拟南芥中超表达及转基因拟南芥的PCR 鉴定
• 1.2.13.1 拟南芥的无土栽培
• 1.2.13.2 拟南芥转化方法
• 1.2.13.3 转基因拟南芥的PCR 鉴定
• 1.2.14 Northern 杂交分析
• 1.2.14.1 总RNA 的提取
• 1.2.14.2 甲醛变性凝胶电泳
• 1.2.14.3 转膜
• 1.2.14.4 预杂交
• 1.2.14.5 探针的制备
• 1.2.14.6 杂交
• 1.2.14.7 洗膜及放射自显影
• 1.2.15 Western 杂交分析
• 1.2.15.1 抗体的制备
• 1.2.15.2 抗血清效价的测定（试管微量沉淀法）
• 1.2.15.3 Western 杂交
• 1.2.16 NtLEA7-3 蛋白的亚细胞定位
• 1.2.17 转NtLEA7-3 基因的烟草及悬浮细胞的抗冷性能分析
• 1.2.17.1 转基因烟草及悬浮细胞的低温胁迫
• 1.2.17.2 离子渗漏率（EL）的测定
• 1.2.17.3 净光合速率、丙二醛含量、烟草悬浮细胞低温胁迫下生长状况的测定
• 2 结果与分析
• 2.1 低温对烟草悬浮细胞生长的影响
• 2.2 烟草悬浮细胞的蛋白质组双向电泳图谱
• 2.3 差异表达蛋白点的质谱鉴定
• 2.4 差异表达蛋白的荧光定量PCR 分析
• 2.5 NtLEA7-3 的体外扩增与克隆
• 2.6 NtLEA7-3 的序列分析
• 2.7 NtLEA7-3 所编码的蛋白质特性分析
• 2.7.1 NtLEA7-3 所编码的蛋白质结构分析
• 2.7.2 疏水性分析
• 2.7.3 跨膜区分析
• 2.7.4 NtLEA7-3 蛋白质结构功能保守区和功能结构域分析
• 2.8 原核表达载体的构建
• 2.9 pET30a-LEA 融合蛋白的诱导和抗体制备
• 2.10 NtLEA7-3 及NtLEA7-3-GFP 融合基因植物表达载体的构建
• 2.11 烟草NtLEA7-3 蛋白的亚细胞定位
• 2.11.1 转基因烟草悬浮细胞及拟南芥的PCR 鉴定
• 2.11.2 NtLEA7-3 蛋白的亚细胞定位分析
• 2.12 烟草NtLEA7-3 基因的功能分析
• 2.12.1 转基因烟草及烟草悬浮细胞的PCR 鉴定
• 2.12.2 转基因株系的Northern 杂交
• 2.12.3 转基因株系的Western 杂交
• 2.12.4 转NtLEA7-3 基因烟草的抗低温胁迫性能分析
• 2.12.5 转NtLEA7-3 基因烟草悬浮细胞的抗低温胁迫性能分析
• 3 讨论
• 3.1 关于NtLEA7-3 的归属
• 3.2 关于NtLEA7-3蛋白的结构
• 3.3 关于NtLEA7-3 蛋白的亚细胞定位和功能
• 4 小结
• 第四章 转CBF1A 基因烟草悬浮细胞的差异蛋白质组学分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 烟草悬浮细胞的培养
• 1.2.2 CBF1A 植物表达载体的构建
• 1.2.3 农杆菌LBA4404 感受态细胞制备及转化
• 1.2.4 CBF1A 基因在烟草悬浮细胞中超表达及转基因细胞的筛选与PCR 鉴定
• 1.2.5 转CBF1A 基因烟草悬浮细胞的Northern 杂交分析
• 1.2.6 烟草悬浮细胞蛋白质的提取
• 1.2.7 蛋白质的纯化、定量、双向电泳分析及质谱鉴定
• 2 结果与分析
• 2.1 转CBF1A 基因烟草悬浮细胞的PCR 鉴定
• 2.2 转CBF1A 基因烟草悬浮细胞的Northern 杂交分析
• 2.3 转CBF1A 基因烟草悬浮细胞蛋白质的双向电泳分析
• 2.4 差异表达蛋白点的质谱鉴定
• 3 讨论
• 4 小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的主要论文