小鼠睾丸引带细胞培养及已烯雌酚对培养睾丸引带细胞的影响

论文摘要

目的:许多研究表明,人类精子数和精液量在明显下降,男性生殖系统分化和发育异常则明显增加,同时环境雌激素（EEs）对男性生殖系统的影响也日益明显,且大多数与睾丸发育、下降不全相关,而睾丸引带与睾丸发育、下降关系密切。目前这方面还有许多问题尚未研究清楚,特别的是在EEs的作用机理方面。本实验通过建立小鼠睾丸引带细胞培养方案,利用经典的EEs己烯雌酚（DES）直接作用于培养的小鼠睾丸引带细胞,观察细胞的形态结构变化,并研究DES对培养小鼠睾丸引带细胞增殖和收缩活性等的影响。以探讨外源性雌激素（EEs）影响睾丸下降的可能机理。材料和方法:小鼠睾丸引带细胞原代培养脱颈椎处死3d大雄性昆明小鼠,消毒后正中剪开下腹部,再次辨认雌雄,在3倍手术放大镜下于膀胱两侧游离出完整睾丸、附睾及睾丸引带,置于PBS中剔除出大部分睾丸引带组织。将引带组织放入含Ⅰ型胶原酶（1mg/ml）的DMEM培养液中,37℃持续震荡消化1小时后,加入3-4倍含无雌激素血清的培养液终止消化作用,静置后取上清液用25μm孔径过滤器过滤,1000r/min离心滤液5min,弃上清。细胞沉淀加入含无雌激素胎牛血清（10%v/v）DMEM培养基,吹打成单个细胞悬液,接种于25cm培养瓶中,置于5% CO2、37℃饱和湿度孵育箱中静置培养。根据不同的培养情况将帖壁的睾丸引带细胞分别传代接种到6孔板和96孔板中。台盼蓝染色计数法确定细胞存活率。DES对小鼠睾丸引带细胞的影响将1ml 4×104/ml的细胞悬液（原代细胞）接种于六孔板中,血清浓度为5%。细胞接种约24小时后,分实验组（DES 0.01μg/ml、0.10μg/ml、1.00μg/ml、10.00μg/ml组）、溶剂对照组（DMSO 1.00μl/ml）和正常组处理细胞。加药后不同时间（12h、24h和48h）获取标本,分别用CCK-8、Western Blot和细胞免疫化学等方法检测小鼠睾丸引带细胞中核增殖抗体（PCNA）、雌激素受体（ERα和ERβ）、F-actin和胞内钙离子浓度（[Ca2+]i）的表达情况。结果:1.培养的小鼠睾丸引带细胞大部分为成纤维样细胞,有少数的上皮样细胞。细胞呈放射状、火焰状或漩涡状走行,胞体呈梭形或不规则三角形,胞质有突起。传代后细胞仍呈成纤维细胞型生长,同源性好,存活率为85%～90%。2.实验组细胞随DES剂量与作用时间生长明显受抑制,细胞生长缓慢,突起回缩,相互间隙增大,细胞轮廓明显,胞质粗糙,内有颗粒堆积,DES剂量越高,细胞越失去成纤维细胞的形态。3. CCK-8方法发现正常组细胞呈持续性增殖,于培养24h后增殖越趋明显。对照组、0.01μg/ml、0.10μg/ml和1.00μg/ml组增殖趋势一致,且数值接近,同一时间段与正常组比较无明显的差异（P>0.05）,而同一组别各时间段与各自12h比较有明显的差异性（P<0.05）。DES10.00μg/ml组于12h开始持续呈半数抑制状态,与其他各组比较有明显的差异（P<0.05）。4.细胞免疫荧光方法发现PCNA严格表达于细胞核中,Western Blot检测10.00μg/ml组的PCNA表达与其他各组比较有明显的差异（P<0.05）,与CCK-8结果大致相同。5.细胞免疫荧光方法发现睾丸引带细胞的F-actin在DES作用后发生明显的解聚,细胞骨架重塑,细胞周边肌动蛋白丝带模糊,应力纤维增加,在融合的细胞单层,粗而长的应力纤维相互交错,结构紊乱。且呈剂量和时间相关性。6.小鼠睾丸引带细胞负载Flou-3荧光探针后在激光扫描电镜下检测[Ca2+]i,发现胞内荧光强度呈DES浓度依赖性增强,DES10.00μg/ml组甚至出现胞内钙的荧光强度呈持续性的高度增强。7.细胞免疫化学发现小鼠睾丸引带细胞上存在ERα和ERβ,ERα表达于胞核,ERβ既表达于胞核又表达于胞浆。结论:1.成功建立了小鼠睾丸引带细胞培养方法。睾丸引带细胞呈成纤维细胞型生长,传代后细胞同源性好,存活率高。2. DES可导致小鼠睾丸引带细胞形态异常、结构紊乱,且与剂量关系密切。3. CCK-8和对PCNA的检测结果都显示DES对小鼠睾丸引带细胞有显著的细胞毒性作用,呈剂量-时间效应。4. F-actin和[Ca2+]i的检测结果提示DES可能通过抑制小鼠睾丸引带细胞的收缩来影响睾丸的正常下降。除经典的胞内受体介导的信息传导途径外,EEs快速影响睾丸引带细胞内各信使的表达还可能通过非基因调控信号途径。5.小鼠睾丸引带细胞存在ERα和ERβ,为EEs作用睾丸引带提供了理论基础。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 主要缩略语中英文对照表
• 前言
• 技术路线
• 实验一：小鼠睾丸引带细胞的培养
• 1 材料
• 2 方法
• 2.1 主要液体配制
• 2.2 原代培养
• 2.3 细胞传代
• 2.4 细胞计数
• 2.5 细胞活性测定
• 2.6 细胞HE染色
• 实验二：己烯雌酚对培养小鼠睾丸引带细胞的影响
• 1 材料
• 2 方法
• 2.1 主要液体配制
• 2.2 睾丸引带细胞培养方法
• 2.3 己烯雌酚（DES）对睾丸引带细胞的作用
• 2.4 细胞免疫荧光染色（PCNA & F-Actin）
• 2.5 细胞 ABC 免疫酶染色（ERα& ERβ）
• 2.6 细胞增值/毒性检测（CCK-8）
• 2.7 细胞内钙的测定
• 2.8 免疫印迹法（PCNA）
• 结果
• 1. 小鼠睾丸引带细胞及己烯雌酚（DES）对其形态的影响
• 2. 己烯雌酚（DES）对睾丸引带细胞增殖性的影响
• 3. 己烯雌酚（DES）对睾丸引带细胞收缩性的影响
• 4. 睾丸引带细胞中雌激素受体（ERα&ERβ）的表达
• 讨论
• 1. 环境雌激素及己烯雌酚
• 2. 雌激素受体及其在雄性生殖系统的表达
• 3. 环境雌激素对雄性生殖系统发育的影响及其作用机制
• 4. 小鼠睾丸引带细胞的培养
• 5. 环境雌激素对睾丸引带的影响及可能的作用机制
• 6. 总结
• 全文小结
• 参考文献
• 综述
• 个人简介
• 致谢