小麦春化相关基因TaVRN2和NF-Y家族基因TaNF-YB3的分离与功能分析

论文摘要

开花是植物生长发育的核心过程,小麦（Triticum aestivum L.）作为一种重要的粮食作物,其开花时间主要受春化作用途径和光周期途径两方面的调节。为了理解小麦开花时间的分子调控机制,本研究分离了小麦开花时间基因TaVRN2,光周期基因CO（WCO1和TaHd1）以及NF-Y（HAP）家族基因,从序列分析和蛋白互作方面研究了它们之间的关系;并对小麦TaVRN2和TaNF-YB3基因的表达模式与生物学功能进行了深入研究。主要结果如下:1.TaVRN2基因的序列特征小麦VRN2基因位点含有ZCCT1和ZCCT2两个基因,我们从六倍体小麦烟农15分离到ZCCT-A1、ZCCT-B1、ZCCT-D1、ZCCT-A2和ZCCT-D2基因,分别含有一个长度为621bp、642bp、639bp、639bp和639bp的开放阅读框,对应地编码206、213、212、212和212个氨基酸残基组成的蛋白。这些蛋白均含有一个锌指结构和一个典型的由43个氨基酸组成的CCT-domain区域,VRN2蛋白在CCT-domain发生了一定的点突变,如ZCCT-A1的R39C,ZCCT-A2的R/K16C。氨基酸序列比较分析与系统进化树分析表明TaVRN2蛋白与其他植物中的同系物高度同源,与单子叶植物的大麦HvZCCT-Ha和HvZCCT-Hb的亲缘关系较近,其次是大麦的CO-like蛋白HvCO9,而与双子叶植物拟南芥的CO-like蛋白亲缘关系相对较远,并且拟南芥中没有VRN2的同源蛋白。2.小麦CO基因和NF-Y家族基因的序列分析分离了六倍体小麦CO的2个候选基因WCO1和TaHd1的编码区全长序列,得到WCO1-2、WCO1-13和WCO1-16三个不同的克隆,以及一个TaHd1-3基因;同时还分离到小麦NF-Y家族的12个基因,即NF-YA的1、3、5、7和NF-YA9的2个不同克隆（NF-YA9-8和NF-YA9-13）基因,NF-YB的3、4、8和11四个基因,NF-YC的6、7和14三个基因。获得的这些小麦CCT-domain相关蛋白以及拟南芥AtCO蛋白的CCT-domain区域,与NF-YA蛋白亚族的核心区域进行氨基酸序列对比,结果表明CCT-domain在这些CCT-domain蛋白中高度保守,并与NF-YA蛋白的核心序列相对保守。NF-YA蛋白包括一个NF-YB/YC结合区、一个接头序列（Linker）和一个DNA结合区,在各物种间保守;NF-YB和NF-YC蛋白的核心区也含有与其他亚基互作和DNA结合所必需的区域,NF-YB亚族彼此间相对保守,但是NF-YC间的相似性则很低。3.小麦TaVRN2、CO与NF-Y的互作关系酵母双杂交实验初步检测了获得的小麦CCT-domain类蛋白与NF-YB和NF-YC的互作情况,但仍需要进一步证实。4.TaVRN2基因的表达分析实时定量RT-PCR检测了TaVRN2基因的部位表达模式,结果表明其主要在早期营养生长的叶片中表达,其他器官和生殖生长阶段表达很低或不表达,而且研究也揭示ZCCT1基因的表达水平在同等条件下均较高于ZCCT2基因。同时,定量RT-PCR的结果也揭示小麦ZCCT1和ZCCT2在LD和SD条件都呈现节奏性表达,并且在光结束时达到表达高峰,而且ZCCT1一般比ZCCT2提前2h到达峰值。这说明TaVRN2受日照长度和生物钟的调控。5.TaVRN2基因的生物学功能分析除了对TaVRN2基因的序列和表达特性进行分析外,我们还对该基因的生物学功能进行了深入的分析。Ubi::ZCCT-A1转基因二穗短柄草Bd21,在LD条件推迟开花,强表型的开花时间大于1.5个生长周期的,野生型6-7片叶开花,强晚花表型13片叶仍处于营养生长。但是,给予4周的春化处理,可以打破晚花表型,使开花时间较野生型晚5天左右,而给予6周的春化处理则达到饱和点,与野生型开花时间完全一致。而且,转基因植株中,春化相关基因VRN1的表达水平明显下降,VRN3的也降低,但VRT2-like基因的表达水平呈上升状态。这表明ZCCT-A1的过量表达导致晚花与其他春化基因的表达水平变化有关联。6.小麦TaNF-YB3基因的序列分析小麦TaNF-YB3基因近全长cDNA含有809个核苷酸,编码199个氨基酸。基因组定位结果显示此基因位于D基因组的3号染色体。与水稻、拟南芥、人类和酵母的HAP3的同源性分析揭示,TaNF-YB3与水稻OsHAP3I的同源性最高,达85%,和拟南芥AtNF-YB3也具有较高的同源性（65%）。但与酵母和人类的较低,分别为50%和47%。进化树分析结果表明其属于不参与胚胎形成的non-LEC1-like分支,与水稻OsHAP3F和OsHAP3I的亲缘关系较近。7.TaNF-YB3基因的表达分析利用实时定量RT-RCR技术检测TaNF-YB3基因的表达模式,分析结果显示,其mRNA主要积累在叶片中,茎中的表达水平一般,几乎不在根中表达;在幼穗、雌蕊和幼胚的表达水平很低。但在雄蕊中表现出较高水平的表达,而且与茎中的积累几乎相同。而且TaNF-YB3基因还响应不同的非生物胁迫,低温与春化作用相似,均抑制其表达。在LD,TaNF-YB3的表达水平高于SD,但LD中给予一段时间的SD,表达骤然上升,这与LD下插入一段SD、4℃春化处理的结果类似,因为插入的SD和春化期间的表达趋势相近,这说明TaNF-YB3基因优先响应LD。TaNF-YB3基因在冬性小麦LD、SD的节奏性表达间接证实了酵母双杂交的结果,因为其无论LD还是SD条件都与小麦TaVRN2的表达模式一致,尤其是与ZCCT1的更相近,但与CO的模式不一致,这能在生物节律钟的同步性上说明二者互做的可能性。8.TaNF-YB3基因的过量表达转基因拟南芥在开花时间上无明显影响35S::TaNF-YB3转拟南芥植株在开花时间上与野生型差异不大,但转基因叶片出现不同程度的的卷曲、分裂,严重的长成线状叶。这说明小麦TaNF-YB3基因影响了叶片的正常发育。而且,有的叶片出现黄化现象,甚至在早期真叶刚发育时呈透明针状叶,可能影响了叶绿素基因的合成。鉴于异源转化拟南芥存在种间差异,TaNF-YB3基因在调节开花时间方面的功能,仍需要结合我们的35S::TaNF-YB3转化二穗短柄草Bd21（处于T0代生长状态）的转基因结果进行深入的验证和核实。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 前言
• 1.1 植物成花诱导的生理机制
• 1.2 植物开花的分子调控机制
• 1.2.1 光周期途径
• 1.2.1.1 光受体感应光周期信号
• 1.2.1.2 昼夜节律钟系统传递光周期信号
• 1.2.1.3 光周期信号诱导下游开花相关基因促进植物开花
• 1.2.2 春化作用途径
• 1.2.2.1 春化作用的基本特征
• 1.2.2.2 春化作用的生理生化特性
• 1.2.2.3 春化作用的分子调控机理
• 1.2.2.4 植物春化作用与低温适应
• 1.2.3 赤霉素途径
• 1.2.4 自主开花途径
• 1.3 麦类植物开花的调控机理
• 1.3.1 小麦VRN1、VRN2 和VRN3 基因是春化相关基因
• 1.3.2 CO 家族基因和HAP 家族基因与植物的开花
• 1.3.3 光周期途径和春化途径调控麦类植物开花的分子机理
• 1.3.4 其他春化相关基因 VRT-2 和 VER2 在春化过程中的作用
• 1.4 转录因子NF-Y/HAP 家族的研究进展
• 1.5 小麦基因异源转化二穗短柄草的优势
• 1.6 本研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料及其生长条件
• 2.1.2 菌株与质粒
• 2.1.3 酶及生化试剂
• 2.1.4 PCR 引物
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 植物组织总RNA 的提取
• 2.2.2 反转录cDNA 第一链的合成
• 2.2.3 cDNA 纯化（用于5′RACE）
• 2.2.4 PCR 扩增
• 2.2.5 连接反应
• 2.2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
• 2.2.7 小量碱法提取质粒 DNA
• 2.2.8 DNA 序列测定与序列分析
• 2.2.9 根癌农杆菌GV3101 或EHA105 感受态细胞的制备与转化
• 2.2.10 目的基因的分离
• 2.2.11 小麦TaVRN2 和TaNF-YB3 基因的表达载体的构建
• 2.2.12 农杆菌介导的二穗短柄草遗传转化
• 2.2.13 农杆菌介导的拟南芥遗传转化
• 2.2.14 小量法提取植物基因组DNA
• 2.2.15 TaVRN2 转基因植株的检测和表型分析
• 2.2.16 小麦TaNF-YB3 基因的功能分析
• 2.2.17 酵母双杂交实验
• 3 结果与分析
• 3.1 小麦TaVRN2 基因的分离与功能分析
• 3.1.1 TaVRN2 基因的克隆与序列分析
• 3.1.2 小麦CO 基因和NF-Y 家族基因的克隆与序列分析
• 3.1.3 小麦TaVRN2、CO 与NF-Y 的互作关系
• 3.1.4 TaVRN2 基因的表达模式分析.
• 3.1.5 TaVRN2 基因转化短柄草延迟植物开花
• 3.2 小麦TaNF-YB3 基因的分离与功能分析
• 3.2.1 TaNF-YB3 基因的克隆与序列分析
• 3.2.2 TaNF-YB3 基因的表达模式分析
• 3.2.3 TaNF-YB3 基因响应不同的胁迫处理
• 3.2.4 TaNF-YB3 基因的表达受光周期的调控
• 3.2.5 TaNF-YB3、CO 和VRN2 基因在小麦叶片中的节奏性表达
• 3.2.6 TaNF-YB3 超表达影响叶片的发育
• 4 讨论
• 5 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢