论文摘要
伤寒沙门菌是一种感染人的病原菌,能够引起腹泻、伤寒、淋巴结病、肝脾大、脑病、肠出血和肠穿孔等一系列疾病,2000年,全球估计发生伤寒病例2100万例,其中约21万人死亡。近年来,由于多重耐药菌株的出现,使得治疗变得更加困难,迫切需要新的诊断、预防和治疗方法。这些都需要对其致病机制的认识,但人是伤寒的唯一宿主,目前还没有适合伤寒研究的动物模型,这给伤寒沙门菌致病机制的认识带来很大困难,因而目前关于伤寒致病机理方面仍然有很多不清楚的环节。致病菌的致病过程是与宿主细胞相互作用的复杂过程,需要许多致病基因的协调作用。致病菌在宿主体内的环境与体外明显不同,为了适应这种环境的变化,细菌会通过调节相应基因的表达作出适应性反应:下调非必须基因的表达,上调在宿主体内存活中起关键作用的基因（例如获得营养的基因和逃避宿主免疫的基因）以及表达那些感染宿主所必须的毒力基因。致病菌在宿主体内表达而在体外不表达的这些功能基因称为“体内诱导基因”（in vivo-induced gene,ivi gene）。大量的研究表明,这些独特的在体内表达而在体外不表达的基因往往对病原菌在体内的生存和致病有重要意义。本文利用“体内诱导表达抗原技术”（in vivo-induced antigen technology,IVIAT）筛选伤寒沙门菌的ivi基因。其研究内容和结果主要包括以下几个方面:1.伤寒病人血清的收集与处理:收集初次就诊并从未进行过抗伤寒药物治疗的伤寒病患者血清,挑选肥达反应效价较高的3个伤寒病人的血清,等体积混合。首先用伤寒沙门菌Ty2、大肠杆菌BL21（DE3）全菌体吸附,然后再依次用细菌超声裂解物和热变性超声裂解物吸附。每步吸附反应结束后,都取出10μl血清,以伤寒沙门菌超声裂解物为抗原,ELISA检查吸附效果。结果显示随着吸附步骤的进行,OD值越来越低,说明相应吸附血清中含有的针对伤寒沙门菌体外表达抗原的抗体越来越少,最后OD值稳定在一定的水平,说明经过吸附处理,血清中已经几乎不含有针对伤寒沙门菌体外抗原的抗体。2.表达文库的构建:表达文库用pET-30abc表达系统构建。该系统由3个质粒构成,一段基因组DNA插入到这三个表达载体后,能保证在可能出现的三种读框中,至少有一种是符合实际序列读框的,从而在诱导表达后获得一个序列正确的蛋白质或肽段。病原菌基因组DNA用Sau3AI进行不完全酶切,酶切产物凝胶电泳,取长度位于0.5～1.5 Kb区域的DNA片段纯化,与预先用BamHI线性化的pET30abc载体DNA进行连接,连接产物电转入感受态大肠杆菌DH5α,接种含卡那霉素平板,收集转化子并回收质粒,再转入大肠杆菌BL21（DE3）。最终获得的基因组文库总量达到6.0×104,90%以上的都是含有插入外源片段的重组质粒,文库总量达到要求所需数量。3.表达文库的筛选:将上述电转获得的表达文库菌液涂布含卡那霉素的LB平板上,使每个平板产生约400个菌落。待菌落长到针尖大小时,将其转印到含卡那霉素和IPTG的LB平板上,经37℃诱导5小时。再将平板放到盛有氯仿的搪瓷盘中,氯仿蒸汽作用15min使菌落部分裂解。将裂解菌落吸附到NC膜上,再用10%脱脂奶粉液封闭过夜。将封闭好的NC膜依次与吸附后血清、辣根过氧化酶标记的羊抗人Ig抗体室温下各反应1h,PBS-T（含0.5%吐温-20的磷酸盐缓冲液）洗涤,ECL增强化学发光试剂盒检测。X光片上明显区别于淡色背景下的黑点所对应的菌落即为初步确定的阳性克隆。将初步确定的阳性克隆和只含pET-30空载体的大肠杆菌BL21（DE3）阴性对照菌同时接种含卡那霉素和IPTG的LB平板,重复以上免疫筛选步骤,进一步确证。提取纯化阳性克隆质粒并测序,PCR克隆全基因,酶切连接到pET30a载体的5’NdeI和3’NotI限制性酶切位点,以只含pET-30a空载体的大肠杆菌BL21（DE3）阴性对照菌,重复以上免疫筛选步骤,进行第三次筛选。最后得到7个ivi基因,他们是bcfD（t0025）, grxC（t3817）,sapB（t1598）, t3663, t3816, t1497和t3689,他们的功能涉及菌毛结构组成,物质运输和代谢。4. RT-PCR验证:LB液体培养基过夜培养伤寒沙门菌Ty2,用TRIzol提取其总RNA,RNase-Free DNase I处理消除DNA后,以所筛选的7个ivi基因设计特异性引物进行RT-PCR扩增,并设立阳性对照。凝胶电泳检测扩增结果显示,t3689, bcfD, sapB, grxC和t3816这5个基因有电泳条带,条带位置基本与基因大小相符,说明它们在体外是有表达的;t3663和t1497这两2个基因没有相应的条带,说明其在体外是没有表达的。综上所述,应用体内诱导抗原技术,本研究筛选到了7个伤寒沙门菌的ivi基因,功能涉及菌毛结构、物质转运和代谢等。为找寻伤寒沙门菌在人体内生存以及致病关键基因的道路上前进了一步,为伤寒的预防和治疗分子靶位的研究积累了有价值的资料。
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标签：伤寒沙门菌论文; 体内诱导抗原技术论文; 筛选论文;