甜高粱秸秆制取燃料乙醇发酵菌种的选育研究

论文摘要

甜高粱为短日照C4植物,光合效率是C3作物的28倍,具有耐干旱、耐水涝、抗盐碱等多重抗逆性及生物产量高,糖分积累快等特点。利用甜高粱发酵生产燃料乙醇,将会成为解决未来能源问题的一条有效途径。本论文对甜高粱秸秆固态发酵六碳糖的菌种选育及其发酵工艺做了研究;并利用发酵后的甜高粱秸秆作为原料制备饲料,为发酵后产物的再利用奠定技术基础;发酵后的甜高粱秸秆纤维素水解产物木糖的发酵菌种选育是一个世界性难题,针对这个难题,本文克隆了木糖代谢途径中的五个关键酶基因,并对转醛酶进行了活性表达。具体内容如下:1)以耐酒精高活性干酵母为原始出发菌株做60Co-γ辐射处理,经多级筛选获得诱变优势菌株H12、H13、H15,再经甜高粱秸秆固态发酵实验,确定H13为最佳诱变菌株。2)研究了最佳诱变菌株H13对甜高粱秸秆固态发酵工艺,得到的最适工艺条件是:粉碎后的甜高粱秸秆300g,5‰的菌体接种量、68%的基质含水量、36℃条件下发酵60h;经测定,乙醇产率达6.4g/100g鲜秸秆,发酵后基质的还原糖含量为0.31%。3)利用发酵后的甜高粱秸秆为原料,采用不同的霉菌分别与酵母H13组合进行发酵,从而确定康宁木霉与酵母H13的组合为最佳发酵菌种组合,并对其发酵条件进行优化。结果表明:每份150g秸秆发酵培养基中辅以15%豆饼粉、2%硫酸铵,含水量为60%,以12%的接种量接入混合菌液（1:1的混合比例）,32℃培养4d,可使发酵饲料中的粗蛋白含量由16.5%提高到21.7%,提高率为31.5%,粗纤维由15.8%降低到12.5%,降幅为20.9%。4)从树干毕赤酵母和酿酒酵母中提取总RNA,通过RT-PCR克隆得到XYL1、XYL2、XKS1、TAL1、TKL1,分别与pGM-T载体连接,转化感受态DH5α,获得转化重组子,测序结果显示,克隆得到的五个基因序列与基因库中所公布的序列同源性达99%以上,其中TAL1的序列同源性为99.90%,氨基酸同源性为100%。5)构建pAUR123-TAL1重组质粒,经测序,其序列与pGM-TAL1的序列完全一致。通过电击转化酿酒酵母,并实现了TAL1在酿酒酵母中的活性表达。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词
• 第一章 绪论
• 1.1 燃料乙醇的发展现状及其研究意义
• 1.1.1 燃料乙醇
• 1.1.2 国内外燃料乙醇产业的发展现状
• 1.1.3 燃料乙醇的研究意义
• 1.2 甜高粱及其制取燃料乙醇产业的发展现状
• 1.2.1 甜高粱作为燃料乙醇原料的优势
• 1.2.2 国内外甜高粱燃料乙醇产业发展现状
• 1.3 菌种的诱变选育
• 1.4 甜高粱秸秆发酵生产燃料乙醇
• 1.5 微生物发酵秸秆饲料的研究
• 1.5.1 微生物发酵秸秆饲料的原理
• 1.5.2 微生物发酵秸秆饲料的菌种
• 1.5.3 微生物发酵秸秆饲料对原料的要求
• 1.6 木糖代谢途径在酿酒酵母中的构建
• 1.6.1 木糖在微生物中的代谢途径
• 1.6.2 木糖代谢途径的引入
• 1.7 本文研究目的意义及内容
• 1.7.1 研究目的意义
• 1.7.2 研究内容
• 第二章 甜高粱秸秆发酵菌株的诱变选育
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 实验仪器
• 2.1.3 实验方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 总糖、还原糖和乙醇含量测定标准曲线图
• 2.2.3 TTC平板一级筛选结果
• 2.2.4 杜氏小管二级筛选结果
• 2.2.5 液态摇瓶发酵三级筛选结果
• 2.2.6 甜高粱秸秆固态发酵最佳菌种确定
• 2.3 讨论
• 第三章 诱变株H13 最佳发酵条件的确定
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 实验仪器
• 3.1.3 实验方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 接种量对甜高粱秸秆固态发酵的影响
• 3.2.2 温度对甜高粱秸秆固态发酵的影响
• 3.2.3 含水量对甜高粱秸秆固态发酵的影响
• 3.2.4 时间对甜高粱秸秆固态发酵的影响
• 3.3 讨论
• 第四章 发酵后甜高粱秸秆制备饲料的研究
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 实验仪器
• 4.1.3 实验方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 最佳发酵菌种组合的确定
• 4.2.2 接种量对饲料发酵的影响
• 4.2.3 基质含水量对饲料发酵的影响
• 4.2.4 硫酸铵的添加量对饲料发酵的影响
• 4.2.5 温度对饲料发酵的影响
• 4.2.6 时间对饲料发酵的影响
• 4.3 讨论
• 第五章 木糖代谢途径相关基因的克隆与序列分析
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 实验材料
• 5.1.2 实验仪器
• 5.1.3 实验方法
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 Total RNA的提取
• 5.2.2 PCR扩增结果
• 5.2.3 DNA与pGM-T载体的连接
• 5.2.4 pGM-TAL1 转化重组子的筛选鉴定
• 5.2.5 克隆基因序列分析
• 5.3 讨论
• 第六章 转醛酶基因在酿酒酵母中的表达
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 实验材料
• 6.1.2 实验仪器
• 6.1.3 实验方法
• 6.2 结果与分析
• 6.2.1 TAL基因的扩增
• 6.2.2 TAL基因与表达载体pAUR123 连接
• 6.2.3 pAUR123-TAL1 转化重组子的筛选与鉴定
• 6.2.4 酿酒酵母转化重组子的筛选与鉴定
• 6.2.5 酿酒酵母转化重组子的表达与活性测定
• 6.3 讨论
• 总结与展望
• 参考文献
• 致谢
• 硕士期间发表论文情况