AHL酶基因的克隆及序列分析

论文摘要

以马铃薯为实验材料,对病原菌萝卜E.C.C的致病能力进行验证分析。确定实验用量为50μl菌悬液。具体分析相同吸光度下每毫升病原菌和拮抗菌芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌的菌液中所含菌落数。结果表明,相同吸光度下不同菌种的每毫升菌液中含大致相同的菌数。然后利用马铃薯作为试验材料对现有的菌种进行筛选,得到结果是对病原菌抑制作用较好的是苏云金芽孢杆菌鲇泽变种ACCC10016,想利用农杆菌试验进一步证明所选菌种,结果没能如愿。抑病试验证明芽孢杆菌Bt4和苏云金芽孢杆菌山东亚种ACCC10314中含有水解AHLs的水解酶——AHLs水解酶。其中,Bt4和病原菌萝卜E.C.C的菌落个数比为2:15,苏云金芽孢杆菌山东亚种ACCC10314和病原菌萝卜E.C.C的菌落个数比为3:15时,就能很好的抑制病原菌对马铃薯的侵染。 分别提取芽孢杆菌的基因组DNA,和载体的质粒DNA。 根据文献发表的基因序列设计特异性引物,以芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌的基因组DNA为模板进行PCR扩增,得到两个大小约为800bp的PCR产物,它们分别来自于Bt4和苏云金芽孢杆菌山东亚种ACCC10314。回收PCR产物,命名为SS1和SS10。 核苷酸序列分析表明,所扩增的两个基因片段大小均为753bp,和基因库中已知的AHLs酶 N-酰基高丝氨酸内酯酶基因aiiA的同源性达96%以上,其活性部位为“106HFDH～199H～221D”。和其他一些苏云金芽孢杆菌比较,同源性高达98%,其中的活性催化中心为His119,His188和Asp210。构建融合表达载体pGEX-SS1和pGEX-SS10,用IPTG对融合蛋白进行诱导表达,琼脂糖凝胶电泳结果表明,其大小为55KDa。然后利用亲和柱层析法纯化融合蛋白。

论文目录

• 第一章 文献综述
• 1.1 引言
• 1.1.1 群体感应
• 1.1.2 革兰氏阴性菌中的群体感应系统
• 1.1.3 革兰氏阳性菌中由寡肽介导的群体效应
• 1.1.4 AHLs酶的分子识别及其分子生物学功能
• 1.1.5 检测acyl-HSL信号分子的方法
• 1.1.6 国内外研究现状
• 1.2 AHLs调控系统与生物防治
• 1.3 研究的目的和意义
• 1.4 本论文研究的主要内容
• 1.4.1 菌种的筛选
• 1.4.2 提取基因组DNA
• 1.4.3 AHLs酶基因的分子克隆及序列分析
• 1.4.4 AHLs酶基因的体外表达和纯化
• 1.4.5 体外研究AHLs酶的水解特性和酶学特征
• 1.4.6 测定
• 第二章 材料与方法
• 2.1 菌种和质粒
• 2.1.1 芽孢杆菌
• 2.1.2 农杆菌报告系统
• 2.1.3 大肠杆菌
• 2.1.4 质粒
• 2.2 培养基和培养条件
• 2.2.1 培养基
• 2.2.2 培养条件
• 2.3 试剂
• 2.3.1 酶类及试剂盒
• 2.3.2 其它药品试剂
• 2.3.3 显色剂
• 2.4 仪器
• 2.5 试验方法和步骤
• 2.5.1 病原菌萝卜E.C.C生长曲线
• 2.5.2 病原菌萝卜E.C.C致病实验
• 2.5.3 平板菌落计数
• 2.5.4 抑病实验
• 2.5.5 农杆菌报告系统实验
• 2.5.6 进一步的实验来验证芽孢杆菌
• 2.5.7 细菌基因组DNA提取
• 2.5.8 聚合酶链式反应（PCR）
• 2.5.9 PCR产物和酶切产物的回收
• 2.5.10 碱裂解法小量提取质粒DNA
• 2.5.11 PCR产物和大肠杆菌E.coli BL21质粒的酶切、电泳
• 2.5.12 酶切产物的回收
• 2.5.13 DNA的连接
• 2.5.14 大肠杆菌JM101感受态细胞的制备
• 2.5.15 转化大肠杆菌
• 2.5.16 阳性克隆
• 2.5.17 克隆片段DNA的测序及序列分析
• 2.5.18 构建表达载体
• 2.5.19 融合蛋白的诱导表达
• 2.5.20 融合蛋白的纯化
• 第三章 结果分析
• 3.1 病原菌萝卜E.C.C的生长曲线
• 3.2 病原菌萝卜E.C.C致病实验
• 3.3 平板菌落计数
• 3.4 抑病实验结果分析
• 3.5 农杆菌报告系统实验结果分析
• 3.6 基因扩增和克隆
• 3.7 T-载体的酶切
• 3.8 重组质粒的双酶切鉴定
• 3.9 SS1和SS10的核苷酸序列及其编码氨基酸序列的同源性分析
• 3.10 SS1和SS10的表达和纯化
• 第四章 讨论
• 第五章 结论
• 参考文献
• 附录A
• 附录B
• 附录C
• 致谢
• 攻读学位期间所取得的相关科研成果