气体信号分子硫化氢对帕金森病模型鼠的神经保护作用及其机制

论文摘要

硫化氢（H2S）是一种内源性气体信号分子,参与哺乳动物众多生物学功能的调节。因此,H2S与一氧化氮和一氧化碳一起被称作“气体递质”。近十年来,人们对于H2S在中枢神经系统（central nervous system, CNS）和心血管系统中作用的研究日益深入,发现H2S作为脑内一种新的神经调质,促进海马长时程增强效应,调节细胞内钙离子稳态和pH水平,调节多种重要的生理功能。已证实H2S代谢异常参与缺血性脑卒中、阿尔茨海默症（AD）、亨廷顿舞蹈病（HD）和反复发作的热性惊厥等中枢神经系统疾病的发生发展。研究也已阐明H2S参与脑内氧化应激、神经炎症和细胞凋亡的调节,可能与帕金森病（Parkinson’s disease, PD）等神经退行性疾病的病理机制相关,但至今尚未见确切报道。PD是一种严重危害中老年人健康、以黑质-纹状体多巴胺（DA）能神经元进行性丢失为主要病理特征、发病率仅次于AD的第二大类神经退行性疾病。在我国65岁以上人群中PD的发病率约2%,占世界PD患者总数的40%以上,且有逐年增高的趋势。预期未来10年内我国罹患PD的人数将占全球患者总数的60%以上。半个多世纪以来,左旋多巴替代疗法一直是临床治疗PD的主要手段。然而,左旋多巴仅能缓解症状,并不能阻止PD的病理进程,且长期使用还可导致许多严重的不良反应。针对DA能神经元损伤的病理机制,尽管已提出兴奋性毒性、线粒体功能障碍、氧化应激、炎症等学说,但导致DA能神经元损伤的确切机制目前仍不清楚,这已经成为制约研发理想治疗药物和临床治疗学突破的瓶颈。显然,加强PD的病因学研究,阐明PD中多巴胺能神经元进行性变性、坏死的病理机制,探索神经保护的新策略,显得十分紧迫和必要。研究已表明AD患者相关脑区内H2S产生和代谢异常,提示H2S可能参与了AD的发生、发展,其机制涉及H2S抗氧化、抗凋亡及抗炎和促炎的双重作用。本实验室前期研究发现,应用外源性H2S可抑制LPS诱导的小胶质细胞活化和鱼藤酮诱导的神经元线粒体功能障碍。而小胶质细胞活化介导的神经炎症和线粒体功能障碍激活的神经元凋亡是PD发生的重要病理机制。尽管研究提示H2S可能与PD相关,但目前尚未获得直接的支持证据。本文工作首先研究内源性H2S与6-OHDA诱导的PD大鼠模型的病理相关性,研究给予外源性H2S对PD模型大鼠行为学和病理学损伤的影响及其作用机制。第二部分工作应用原代培养的大鼠星形胶质细胞建立氧化损伤细胞模型,研究H2S对星形胶质细胞损伤的保护作用,阐明H2S对谷氨酸摄取功能的影响及机制。第三部分工作应用野生型（wild-type,WT）小鼠、Kir6.2敲除（Kir6.2 knockout,Kir6.2-/-）小鼠和线粒体解耦联蛋白2敲除(UCP2 knockout,UCP2-/-)小鼠,建立亚急性MPTP/p PD小鼠模型,研究H2S对PD小鼠病理学和神经递质水平的影响,阐明H2S对PD发挥神经保护作用的靶点和可能的分子机制。本文工作的研究结果为H2S参与PD病程的发生、发展提供直接的支持证据,并阐明外源性H2S在PD神经损伤中发挥多靶点的保护作用,为PD的临床治疗学提供新的思路和策略。目的:研究、阐明H2S与PD的相关性及外源性H2S对PD模型大鼠的神经保护作用。方法:建立单侧纹状体立体定位注射6-OHDA诱导的PD大鼠模型,通过皮下注射阿扑吗啡诱导动物对侧旋转行为。筛选出成功的PD大鼠给予NaHS（1.68 mg/kg和5.6 mg/kg,i.p.）治疗3周,动态观测行为学症状的变化。给药结束后,处死大鼠、灌注取脑并收集新鲜脑组织。醋酸锌法测定相关脑区H2S浓度;免疫组织化学染色观察中脑黑质和纹状体TH神经元损伤;应用Western-blotting法检测上述脑区酪氨酸羟化酶表达;应用MDA试剂盒测定中脑脂质过氧化产物MDA含量。培养SH-SY5Y神经元细胞株,分离纯化胞浆蛋白和胞膜蛋白,应用Western-blotting法检测NADPH氧化酶胞膜亚基gp91的表达及胞浆亚基p47从胞浆向胞膜转运情况。结果:1)单侧纹状体内注射6-OHDA四周后,阿扑吗啡诱导的PD模型大鼠出现明显的健侧旋转行为,表明模型建立成功;相较于伪手术组大鼠,6-OHDA模型大鼠患侧纹状体内H2S浓度显著降低（P<0.05）,健侧亦有下降趋势,但无显著性差异（P>0.05）,提示脑内内源性H2S与PD的发生、发展密切相关。2)NaHS治疗3周显著抑制模型大鼠对侧旋转症状进行性加重,且显著改善6-OHDA诱导的患侧黑质致密部和纹状体内多巴胺能神经元减少;同时,Western blotting分析发现NaHS逆转上述脑区酪氨酸羟化酶（TH）表达的下调。3)NaHS显著减轻6-OHDA引起的纹状体内MDA合成增加,提示H2S对PD模型大鼠的神经保护作用与其抗氧化应激损伤相关;整体和离体研究均证实NaHS显著抑制NADPH氧化酶膜亚基gp91表达上调和胞浆亚基p47的转运,且该作用依赖抑制ERK1/2磷酸化。结论:1、脑内H2S水平与6-OHDA诱导的PD大鼠模型的发生、发展相关。2、外源应用H2S能够改善模型动物行为学和病理学损伤,发挥神经保护作用。3、H2S神经保护作用的机制涉及抑制NADPH氧化酶活化,减轻氧化应激损伤。目的:研究H2S对原代培养的SD大鼠星形胶质细胞损伤的保护作用及其对谷氨酸摄取功能的影响,阐明H2S对PD的神经损伤发挥保护作用的细胞与分子机制。方法:分离、培养SD大鼠脑内星形胶质细胞,给予内源性氧化物质H2O2,建立损伤模型,研究H2S对H2O2诱导的星形胶质细胞损伤作用的调节。MTT法和LDH检测研究H2O2和H2S对星形胶质细胞活力的影响。GSH和ROS水平测定观察H2S的抗氧化应激作用。应用同位素标记的谷氨酸摄取实验检测H2S对星形胶质细胞谷氨酸再摄取功能的影响。应用Western-blotting法观察星形胶质细胞谷氨酸转运体GLT-1在细胞内的转运（trafficking）状态以及调节其转运的MAPK信号通路的活化情况。结果:1)H2S供体NaHS呈浓度依赖性地减轻H2O2（200μM）引起的星形胶质细胞活力下降和LDH释放增加;NaHS（100μM）预处理15分钟逆转H2O2引起的细胞内抗氧化物质还原型谷胱甘肽（GSH）的合成减少。上述作用均可被特异性谷氨酸摄取抑制剂PDC所取消;同时,NaHS改善H2O2引起的胞内ROS蓄积和ATP生成减少。2)H2S合成酶CBS抑制剂AOAA加重H2O2所致星形胶质细胞活力下降、LDH释放增加以及裂解型PARP蛋白表达上调,提示内源性H2S参与细胞内抗氧化损伤作用。3)NaHS预处理逆转H2O2损伤的星形胶质细胞[3H]谷氨酸摄取功能,且促进谷氨酸转运体GLT-1从胞浆向胞膜转运。同时发现ERK1/2磷酸化抑制剂PD98059具有相似的作用。NaHS显著抑制H2O2激活的ERK1/2磷酸化,表明H2S通过MAPK信号通路影响GLT-1的转运。结论:1、离体研究发现H2S增强SD大鼠星形胶质细胞谷氨酸摄取功能,促进胞内抗氧化物质GSH合成,可能是H2S对氧化应激损伤发挥保护作用的主要机制之一。2、硫化氢抑制谷氨酸转运体氧化失活,促进其从胞浆向胞膜转运,并保障主动摄取所需的能量,从而调节星形胶质细胞谷氨酸摄取功能。目的:应用野生型（wild-type,WT）、Kir6.2敲除(Kir6.2 knockout,Kir6.2-/-)和UCP2敲除(UCP2 knockout,UCP2-/-)小鼠,建立亚急性MPTP/p PD小鼠模型,从整体、细胞及分子水平研究、阐明H2S对PD的神经保护作用及其机制。方法:应用MPTP(20 mg·kg-1)皮下注射,间隔1小时腹腔注射丙磺舒(250 mg·kg-1),连续给药5天,制备亚急性PD小鼠模型。给药结束后2天进行5-溴脱氧尿核苷(5-bromodeoxyuridine,BrdU,50 mg·kg-1,i.p. every 2 h,共4次)标记。NaHS(5.6 mg·kg-1·day-1, i.p.)在MPTP首次给药前3天应用,连续给药8天。造模结束后3.5天处死动物,收集标本。应用免疫组织化学结合体视学计数、ImageJ软件分析黑质致密部（substantia nigra pars compacta, SNpc）DA能神经元损伤;同时检测黑质致密部星形胶质细胞和小胶质细胞增殖活化;室管膜下层（subventricular zone, SVZ）和颗粒细胞下层（subgranular zone, SGZ）神经再生情况;应用高效液相色谱法（HPLC）检测纹状体脑区单胺类及氨基酸类神经递质及其代谢产物水平的变化。离体培养小鼠中脑神经元,应用免疫细胞化学染色检测MPP+所致神经元数目及突起长度损伤;应用Western-blotting分析内质网应激启动的GRP78、CHOP和Caspase12及溶酶体自噬标志物LC3的表达。结果:1)在亚急性MPTP/p PD模型中,Kir6.2+/+和Kir6.2-/-两种基因型小鼠中脑TH神经元损伤,胶质细胞活化,神经再生及纹状体单胺类和氨基酸类递质水平变化均无显著性差异（p>0.05）。2)NaHS预处理提高模型中Kir6.2+/+和Kir6.2-/-两种基因型小鼠的存活率,且显著改善两种基因型小鼠黑质致密部TH神经元减少、星形胶质细胞和小胶质细胞的增殖活化;减轻SGZ区神经干细胞增殖的抑制（p<0.05）;但对纹状体DA及其代谢产物水平改变无显著影响（p>0.05）。3)NaHS改善MPP+诱导的两种基因型中脑TH神经元数目和平均突起长度减少。其机制涉及NaHS抑制MPP+引起的内质网应激中蛋白伴侣分子GRP78、转录因子CHOP、效应分子Caspase12和溶酶体自噬标志物LC3的表达上调,并抑制下游NF-κB信号通路的激活。4)线粒体内膜解耦联蛋白2（uncoupling protein 2,UCP2）敲除取消NaHS对亚急性MPTP模型小鼠SNc区TH神经元的保护作用,同时取消NaHS改善MPP+导致离体培养的中脑TH神经元数目和平均突起长度减少,LDH释放增加的作用,提示H2S的神经保护作用依赖UCP2。结论:1、H2S对MPTP/p PD模型小鼠的神经损伤具有确切的保护作用。2、H2S的神经保护作用不依赖Kir6.2/K-ATP通道,线粒体内膜上的UCP2可能是H2S的作用靶点。3、H2S抑制ROS引起的内质网应激及下游凋亡通路,发挥神经保护作用。综上所述,本文工作的主要创新之处在于:1、阐明内源性H2S与PD的发生、发展密切相关本文研究发现神经毒素诱导的PD模型大鼠相关脑区内H2S水平显著降低,提示脑内H2S水平降低参与了PD的发生发展过程,为H2S与PD的相关性提供了直接的实验证据。2、发现外源性H2S对PD的神经损伤具有保护作用通过在体和离体研究,发现应用外源性H2S对PD模型动物出现的行为学症状、TH神经元丢失、星形胶质细胞功能障碍、小胶质细胞增殖活化和神经干细胞增殖抑制均有显著的改善作用,在学术界首次报道H2S作为一种神经保护剂对PD神经损伤具有确切的保护作用,为临床防治PD提供了新的思路和策略。3、揭示H2S对PD模型动物的神经保护作用不依赖K-ATP通道本文研究发现敲除表达于神经元的K-ATP通道孔道形成亚基Kir6.2,不能取消H2S对PD模型小鼠神经损伤的保护作用,表明H2S对PD小鼠的神经保护作用不依赖K-ATP通道。而线粒体UCP2敲除则能取消H2S对中脑TH神经元的保护作用,提示H2S的作用靶点可能是位于K-ATP通道上游的UCP2。该发现不仅揭示了H2S保护作用的机制,也为PD的神经保护和研发理想治疗药物提供了有益的靶标。

论文目录

• 英文缩略词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 一、硫化氢的生理功能
• 二、帕金森病研究现状
• 三、帕金森病的动物模型
• 四、帕金森病神经保护治疗的新策略
• 五、本文研究工作的主要内容及其意义
• 第一部分 硫化氢对6-OHDA诱导的PD模型大鼠神经损伤的保护作用及其机制
• 引言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 2O₂诱导的星形胶质细胞损伤的保护作用及其机制'>第二部分 硫化氢对H₂O₂诱导的星形胶质细胞损伤的保护作用及其机制
• 引言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 第三部分 硫化氢对亚急性MPTP PD 模型小鼠的神经保护作用及其机制
• 引言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 结语
• 参考文献
• 附录 综述
• 参考文献
• 附录 在读期间发表的相关文章
• 致谢