论文摘要
背景与目的结肠癌是临床最常见的恶性肿瘤之一,化疗在其治疗手段中占有重要地位,但不同个体对不同化疗方案的敏感性具有很大差异,很多患者疗效不佳,肿瘤细胞对抗肿瘤药物的多药耐药（multidrug resistance, MDR）一直是多种恶性肿瘤化疗失败的主要原因。所谓MDR是肿瘤细胞不单对原使用的药物产生耐药,同时对与之结构、作用机制完全不同的药物也产生交叉耐药。在引起MDR的众多机制中,目前研究的相对焦点则是多药耐药基因及其编码的蛋白,即人类MDR1基因的高表达,及其编码的膜P-糖蛋白（P-glycoprotein, P-gp）量的增加。P-gp是一种ATP酶活性的跨膜药物转运蛋白,能够转运多种结构和功能不同的化疗药物,将摄入细胞内的药物泵出,促使其外流而维持细胞内化疗药物的低浓度水平。在P-gp蛋白过表达的肿瘤细胞常表现对多种化疗药物的耐药,导致肿瘤化疗的失败。而实体瘤结肠癌中肿瘤细胞缺氧是一种常见的现象,在缺氧引起的肿瘤细胞生物学特性改变中,缺氧诱导因子-1（hypoxia-inducible factor-1, HIF-1）起着重要作用。HIF-1α的过表达存在于大多数人类肿瘤细胞中,并与多种肿瘤的预后存在一定的相关性,且缺氧可导致肿瘤细胞对化疗药物抵抗性增加[1]。那么HIF-1α是否与肿瘤多药耐药的关键基因MDR1/P-gp相互作用也参与到结肠癌MDR的发生中?HIF-1α是否也是参与结肠癌化疗耐受的关键基因?如果对HIF-1α表达进行特异性抑制,能否在基因水平实现对结肠癌MDR的逆转呢?因此,更好的理解缺氧给结肠癌MDR带来的影响将有助于提高化疗效果。鉴于此,本课题拟观察结肠癌组织标本中HIF-1α与P-gp的表达和分布情况,检测四种结肠癌细胞株经低氧处理后HIF-1α与MDR1/P-gp的表达变化情况;构建慢病毒载体介导的HIF-1α与MDR1两套miRNA干扰体系,在建立的LoVo细胞多细胞球（multicellular spheroids, MCS）培养体系内研究其经低氧诱导产生MDR表型并有效沉默HIF-1α或MDR1基因表达后,LoVo MCS化疗敏感性及药物诱导凋亡水平变化情况,观察耐药逆转效率,旨在探讨以HIF-1α为靶点从基因水平实现对结肠癌MDR逆转的可能机制及可行性,为针对HIF-1α基因逆转结肠癌耐药的靶向性表达治疗策略提供理论基础和实验依据。方法1、通过免疫组织化学染色及免疫荧光双标染色技术观察结肠癌组织标本中HIF-1α与P-gp的表达和分布情况,了解二者在结肠癌组织中表达的关系及与肿瘤分期、淋巴转移等临床病理参数的关系。2、采用免疫细胞化学染色及RT-PCR技术分别在常氧及低氧培养条件下检测四种结肠癌细胞株中HIF-1α与MDR1/P-gp的表达变化情况,初步探讨肿瘤低氧微环境对HIF-1α及MDR1/P-gp表达的影响及二者表达的变化关系。3、设计合成分别针对靶基因HIF-1α与MDR1的各2组pre-miRNA干扰序列,构建带有报告基因EmGFP的pcDNA?6.2-GW/EmGFP-miR-HIF-1α及pcDNA?6.2-GW/ EmGFP-miR-MDR1两套干扰质粒,双酶切及测序鉴定质粒构建成功后,应用脂质体LipofectamineTM 2000分别介导两套miR干扰质粒转染LoVo细胞,经杀稻瘟菌素筛选稳定阳性克隆,利用半定量RT-PCR技术检测两种干扰质粒转染后相应目的基因mRNA表达抑制情况,分析其干扰效果及两种靶基因可能的作用关系,从而在备选的4组pre-miR RNA干扰序列中挑选出分别针对靶基因HIF-1α与MDR1干扰效果最佳的1组进行下游miR慢病毒表达载体的构建。4、选取上一部分鉴定出的干扰效果最佳的两组miR干扰质粒,应用Gateway重组反应技术构建分别针对靶基因HIF-1α与MDR1的两套miR慢病毒表达克隆pLenti6/V5-GW/EmGFP-miR-HIF-1α与pLenti6/V5-GW/EmGFP-miR-MDR1,应用脂质体LipofectamineTM 2000介导法,共转染ViraPower?混和慢病毒包装质粒体系入293FT细胞产毒,产毒上清经感染NIH/3T3细胞进行滴度测定。而后将HIF-1α与MDR1两套miR重组慢病毒干扰体系分别感染LoVo细胞,经杀稻瘟菌素稳定筛选后,利用半定量RT-PCR及Western blot技术分别检测干扰后HIF-1α与MDR1基因mRNA及蛋白的表达变化情况,并进一步在蛋白水平分析两种基因可能存在的作用关系。5、采用三维培养的方法分别建立稳定感染HIF-1α或MDR1 miR重组慢病毒及亲本LoVo细胞的多细胞球（MCS）培养体系,经低氧培养处理,模拟体内肿瘤细胞微环境,以建立体外经低氧诱导的LoVo MCS耐药模型,并采用流式细胞术分别检测各组LoVo MCS的细胞周期分布情况;随后利用Western blot技术检测HIF-1α及MDR1 miR慢病毒干扰体系在低氧诱导的LoVo MCS水平对相应目的基因的沉默效果并与常氧培养的正常LoVo MCS中目的基因蛋白表达情况作比较。6、应用MTT法检测亲本LoVo MCS分别在常氧培养及低氧处理后对ADR、VCR、5-Fu和CPT-11四种药物化疗敏感性的变化,并在低氧诱导的LoVo MCS多药耐药模型水平,分别检测HIF-1α和MDR1两套miR重组慢病毒感染组细胞对上述四种化疗药物敏感性的变化,观察其耐药逆转情况。7、应用流式细胞术检测各组LoVo MCS分别经ADR、VCR、5-Fu和CPT-11四种化疗药物作用,诱导细胞凋亡的情况。结果1、结肠癌组织标本观察到HIF-1α主要表达在肿瘤细胞的胞浆和（或）胞核,肿瘤坏死明显的区域内和肿瘤浸润边缘尤为多见,P-gp表达主要定位于肿瘤细胞的胞浆和胞膜;HIF-1α与P-gp蛋白阳性表达率分别为58.6%、46.6%;二者的表达不受患者性别、年龄、肿瘤位置及肿瘤分化程度的影响（P>0.05）;肿瘤有淋巴结转移者HIF-1α与P-gp的阳性表达率高于无淋巴结转移者（P<0.05）;随着Dukes分期进展,HIF-1α与P-gp表达率逐渐增高,C、D期表达情况较A、B期有显著差异（P<0.05）;二者在结肠癌组织中的表达呈显著正相关（γ=0.574, P<0.01）;免疫荧光双标染色结果显示HIF-1α与P-gp在结肠癌组织中明确存在共表达现象。2、四种结肠癌细胞株（HCT-116, HT-29, LoVo, SW480）在常氧培养条件下HIF-1α与MDR1 mRNA及蛋白表达均很弱;低氧处理24 h后,四种细胞株中HIF-1α与MDR1/P-gp的表达水平均显著提高,差异具有统计学意义（P<0.01）;而二者在同种培养条件下四种细胞株之间的表达量则无明显差异（P>0.05）。3、成功构建带有报告基因EmGFP的pcDNA?6.2-GW/EmGFP-miR-HIF-1α（MDR1）两套干扰质粒,并能成功转染LoVo细胞,半定量RT-PCR显示与未处理组及阴性对照组相比较,HIF-1α与MDR1 miRNA干扰质粒组均能够特异并有效地抑制相应目的基因mRNA的表达（P<0.01）;同时发现,HIF-1αmiRNA干扰质粒组MDR1 mRNA表达水平与未处理组及阴性对照组相比也发生了显著下降（P<0.01）,而相反的, MDR1 miRNA干扰质粒组中HIF-1αmRNA的表达水平与未处理组及阴性对照组相比则无明显变化（P>0.05）;通过比较各质粒干扰效率,筛选出了分别针对HIF-1α与MDR1基因的最佳干扰质粒用于后续慢病毒干扰体系的构建。4、成功构建分别针对HIF-1α与MDR1的两套miR重组慢病毒表达质粒pLenti6/V5-GW/EmGFP-miR-HIF-1α（MDR1）,经包装293FT细胞产毒后可以稳定感染LoVo细胞。半定量RT-PCR及Western blot结果显示HIF-1αmiR慢病毒感染组中HIF-1α与MDR1 mRNA及蛋白（HIF-1α与P-gp）表达量均显著低于未处理组和慢病毒阴性对照感染组（P<0.01）;在MDR1 miR慢病毒感染组中,MDR1 mRNA及P-gp蛋白表达水平也均显著低于未处理组和阴性对照组（P<0.01）,而HIF-1αmRNA及蛋白的表达水平则没有受到影响,与未处理组及阴性对照组之间无明显差异（P>0.05）。5、成功建立亲本LoVo MCS与LoVo MCS/LVV-HIF-1α（MDR1） miR模型,流式细胞术检测细胞周期分布结果显示:与亲本LoVo MCS常氧组相比,LoVo MCS低氧组G1期比例明显增高（P<0.01） ,同时S期与G2期比例下降（P<0.01） ; LoVo MCS/LVV-HIF-1αmiR组与LoVo MCS低氧组相比较,G1期比例显著减少（P<0.01）,同时S期与G2期比例明显增高（P<0.01）;而LoVo MCS/LVV-MDR1 miR组与LoVo MCS低氧组相比较,G1期、S期及G2期各期比例则无明显差异（P>0.05）。Western blot结果显示:LoVo MCS中两种目的蛋白的表达水平低氧组显著高于常氧组（P<0.01）,HIF-1α与MDR1两套miR慢病毒干扰体系感染的LoVo细胞所建立的MCS中相应目的蛋白的表达均得到了有效的抑制,抑制率分别达到76.0%与74.5%,而neg-miR阴性对照组与亲本细胞未处理组之间蛋白表达量并无差异（P>0.05）。6、四种药物在低氧处理后的LoVo MCS中敏感性均有不同程度下降,IC50值均高于相应的常氧组（ADR、VCR、5-Fu,均P<0.01,显著耐药;CPT-11,P>0.05,差异不显著）。LoVo MCS/LVV-HIF-1αmiR组中沉默HIF-1α基因后,LoVo细胞对ADR、VCR及5-Fu的敏感性均有不同程度的恢复,对ADR的耐药性从9.92-fold降至2.62-fold,耐药逆转81.78%（P<0.01）;VCR的耐药性从6.10-fold降至1.92-fold,耐药逆转82.04%（P<0.01） ; 5-Fu的耐药性从4.94-fold降至2.26-fold ,耐药逆转68.00%（P<0.01）; CPT-11耐受性从1.18-fold降至1.08-fold,但沉默HIF-1α前后并无统计学差异（P>0.05）。对于LoVo MCS/LVV-MDR1 miR组,沉默MDR1基因后,LoVo细胞对ADR与VCR的耐药性有所逆转,对ADR的耐药性从9.92-fold降至3.21-fold,耐药逆转75.24%（P<0.01）;VCR的耐药性从6.10-fold降至1.71-fold,耐药逆转86.04%（P<0.01）;而5-Fu与CPT-11的IC50值与低氧组相比无明显差异（P>0.05）,表明沉默MDR1基因表达对二者化疗敏感性变化无明显影响。7、流式细胞仪检测细胞凋亡结果显示:与常氧培养的亲本LoVo MCS相比,低氧诱导的耐药LoVo MCS经上述药物诱导的凋亡水平均都有不同程度的下降,其中ADR、VCR及5-Fu作用后细胞凋亡水平分别是相应亲本细胞常氧组的11.10%、12.30%和30.58%,差异具有统计学意义（P<0.01）;而CPT-11作用后的低氧组凋亡水平虽有下降,但与常氧组相比并无明显差异（P>0.05）。两套miR慢病毒干扰体系对低氧耐药组细胞的凋亡诱导结果显示:与耐药LoVo MCS凋亡水平相比较,LoVo MCS/LVV-HIF-1αmiR组细胞通过沉默靶基因HIF-1α表达后,ADR、VCR及5-Fu诱导的凋亡水平均明显提高（P<0.01）,分别是相应耐药组的9.18、7.38和2.64倍,;而经CPT-11作用后的HIF-1α干扰组细胞凋亡水平仅是低氧组的1.05倍,并无统计学意义（P>0.05）;对于LoVo MCS/LVV-MDR1 miR组而言,通过沉默靶基因MDR1表达后,与耐药LoVo MCS凋亡水平相比较,ADR和VCR诱导的凋亡水平均有显著提高（P<0.01）,分别是相应耐药组的8.69和7.23倍,而经5-Fu或CPT-11所诱导的凋亡水平与低氧组相比则均无明显差异（P>0.05）。结论1、HIF-1α与P-gp在结肠癌组织中存在过表达和共表达现象,其表达不受患者性别、年龄、肿瘤位置、分化程度的影响,但在不同Dukes分期和是否伴随淋巴结转移等因素中二者表达阳性率呈显著差异,且二者表达呈显著正相关。2、低氧可以诱导结肠癌细胞中HIF-1α与MDR1/P-gp在mRNA及蛋白水平表达均显著升高,HIF-1α可能通过与MDR1/P-gp直接或间接的相互作用而参与了结肠癌多药耐药的发生。3、构建的分别针对靶基因HIF-1α与MDR1的两套miR慢病毒干扰体系可以分别在结肠癌LoVo细胞单层培养及MCS水平特异并有效地沉默相应目的基因mRNA及蛋白表达,且沉默HIF-1α的表达,能同时引起MDR1/P-gp表达显著下降,推测在低氧条件下,HIF-1α有可能作为MDR1上游的一个信号分子来直接或间接的激活或诱导其表达上调。4、低氧可以诱导结肠癌亲本LoVo MCS产生MDR表型,形成有效的耐药模型,对ADR、VCR及5-Fu均产生不同程度耐药,对CPT-11的敏感性也有所下降,但无统计学意义。沉默MDR1基因可以逆转由P-gp经典耐药途径介导的LoVo MCS对ADR和VCR产生的耐药;沉默HIF-1α基因可以有效逆转LoVo MCS对ADR、VCR及5-Fu产生的耐药,耐药逆转机制可能与其诱导MDR1/P-gp的表达、参与细胞周期的调控、抑制细胞凋亡等多因素相关。5、LVV-HIF-1αmiR干扰体系可以明显促进阻滞于G1期的细胞向S期过渡,参与细胞周期调控,联合ADR、VCR或5-Fu共作用可以显著诱导结肠癌耐药LoVo MCS发生细胞凋亡,提高化疗效果。6、CPT-11的化疗耐受机制不依赖于P-gp介导的经典耐药途径,可能通过其活性代谢产物SN-38对HIF-1α的抑制作用等其他途径使得其在肿瘤低氧微环境中保持一定的药物敏感性。
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