ITS序列和β-香树酯醇合成酶基因与甘草酸形成和积累的相关性研究

论文摘要

甘草酸含量是甘草质量的重要标志之一,但是不同种的甘草、不同季节收获的甘草、不同产地的甘草、同一产地不同的甘草个体、甘草不同部位的甘草酸都存在含量差异,而且这种差异严重影响甘草药材的临床疗效及其稳定性;而且由于甘草酸含量的差异,导致对甘草种质资源的药用价值评价难于进行。因此,揭示甘草酸形成和积累的机制,寻找和甘草酸形成和积累相关的分子标记对探讨调控甘草药材的质量,评价药用甘草种质资源具有重要意义。目前探讨基因和活性成分相关性所选择的研究对象包括基因组和单个基因。以基因组如RAPD、AFLP等为研究对象,反映的是植物所有差异的总和,不能直接反映活性成分含量的变异。而且化学成分的差异可能是由有限的遗传差异决定,基因组变异的聚类可能反映不出其变化;而以单个基因如matK基因、ITS序列等为研究对象,如果选定的基因非编码基因,则只能反映它本身的分化,只有它和反映活性成分含量的基因同步进化时才能反映出活性成分含量的变异。活性成分的功能基因的多态性可能更能反应活性成分的变化,但功能基因较长,作为直接选择指标困难较大。为此,可通过通用基因进行间接选择,或通过功能基因进行研究,寻找和活性成分含量变异密切相关的基因,为探讨活性成分含量变异的基因机制奠定基础。为揭示甘草酸的形成机制,本文首先将实验材料分成两组:含甘草酸组和不含甘草酸组,通过比较两组ITS序列和β-香树酯醇合成酶基因第一外显子（简称β-香树酯醇合成酶基因）的序列差异,试图揭示甘草酸形成（甘草酸的有无）和基因的相关性;然后根据不同甘草酸含量,把实验材料分成高甘草酸含量组和低甘草酸含量组,通过比较它们的ITS序列和β-香树酯醇合成酶基因差异,揭示甘草酸积累和基因分化的相关性;本文还比较了甘草的不同器官的β-香树酯醇合成酶基因的表达差异,揭示不同器官中甘草酸积累和基因表达的相关性。主要结论如下:（1）基于ITS序列和5.8S基因序列差异划分的基因型和甘草酸形成具有密切关系。根据ITS序列差异将甘草属植物划分成两个基因型,TTCCTG基因型和ACTTGT基因型。其中,TTCCTG基因型均形成甘草酸,ACTTGT基因型不形成甘草酸;根据5.8S序列也可将甘草属植物划分成A和G两个基因型,其中,A基因型形成甘草酸, G基因型不形成甘草酸。（2）黄甘草和胀果甘草、蜜腺甘草和光果甘草的ITS序列完全相同,支持黄甘草和胀果甘草合并,蜜腺甘草和光果甘草合并的分类处理,研究结果认为黄甘草和蜜腺甘草均可作为药用甘草资源使用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 1. 研究现状及立题依据
• 1.1 立题意义与立体背景
• 1.1.1 中药材活性成分含量变异研究现状
• 1.1.2 基因与活性成分含量变异的相关性研究现状
• 1.1.3 药用植物基因多态性的研究方法
• 1.1.4 药用植物基因多态性研究现状
• 1.1.5 基因表达研究方法及现状
• 1.1.6 甘草酸的生合成及其关键酶基因研究现状
• 1.2 研究内容、研究目标、技术路线和拟解决的关键问题
• 1.2.1 研究内容
• 1.2.2 研究目标和拟解决的关键问题
• 1.2.3 技术路线
• 2. ITS序列多态性和甘草酸形成的相关性研究
• 2.1 材料、试剂和仪器
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 常规试剂及其配制
• 2.1.3 DNA提取、检测、ITS序列扩增相关试剂
• 2.1.4 主要仪器和设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 基因组DNA的提取和纯化
• 2.2.2 DNA的检测
• 2.2.3 PCR扩增反应体系及其优化
• 2.2.4 引物设计
• 2.2.5 PCR产物的回收、纯化
• 2.2.6 序列测定
• 2.2.7 序列排列和分析
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 总DNA的质量
• 2.3.2 优化的PCR反应条件
• 2.3.3 PCR产物的纯化
• 2.3.4 甘草属植物的ITS序列
• 2.4 分析与讨论
• 2.4.1 ITS序列特征
• 2.4.2 ITS序列多态性和甘草酸形成的关系
• 2.4.3 5.85 rRNA序列多态性和甘草酸形成的关系
• 2.4.4 甘草酸组内ITS序列多态性分析
• 2.4.5 蜜腺甘草、黄甘草可做为药用甘草使用
• 2.5 小结
• 3 Β-香树酯醇合成酶基因多态性与甘草酸形成相关性研究
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 实验材料、试剂和仪器
• 3.1.2 实验方法
• 3.1.3 引物设计
• 3.2 实验结果
• 3.2.1 DNA质量
• 3.2.2 PCR扩增反应体系的优化
• 3.2.3 PCR扩增程序的优化
• 3.2.4 测序结果
• 3.3 讨论与分析
• 3.3.1 β-香树酯醇合成酶基因序列特征分析
• 3.3.2 β-香树酯醇合成酶基因多态性和甘草酸形成的相关性
• 3.3.3 β-香树酯醇合成酶基因多态性和甘草酸积累的相关性
• 3.3.4 β-香树酯醇合成酶氨基酸序列特征
• 3.3.5 β-香树酯醇合成酶氨基酸序列多态性和甘草酸形成的相关性
• 3.4 小结
• 4 ITS序列和甘草酸积累的相关性研究
• 4.1 不同种群（产地）甘草中甘草酸含量研究
• 4.1.1 材料、试剂、标准品和仪器
• 4.1.2 实验方法
• 4.1.3 实验结果
• 4.2 不同种群（甘草）的ITS序列分析
• 4.2.1 材料、试剂和仪器
• 4.2.2 实验方法
• 4.2.3 实验结果
• 4.3 分析与讨论
• 4.3.1 非特异条带产生的原因及去除
• 4.3.2 ITS序列和甘草酸含量变化的关系
• 4.4 小结
• 5 Β-香树酯醇合成酶基因多态性和甘草酸积累的相关性研究
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 实验材料
• 5.1.2 实验方法
• 5.2 实验结果
• 5.2.1 DNA质量
• 5.2.2 优化的PCR条件
• 5.2.3 β-香树酯醇合成酶基因测序结果
• 5.3 分析与讨论
• 5.3.1 β-香树酯醇合成酶基因特征分析
• 5.3.2 β-香树酯醇合成酶基因多态性及聚类
• 5.3.3 β-香树酯醇合成酶基因多态性和地理来源的相关性
• 5.3.4 β-香树酯醇合成酶基因多态性和传统甘草药材分类的相关性
• 5.3.5 β-香树酯醇合成酶基因型和甘草酸积累的相关性
• 5.3.6 β-香树酯醇合成酶的氨基酸序列差异分析
• 5.4 小结
• 6 Β-香树酯醇合成酶基因表达和甘草酸积累的相关性研究
• 6.1 甘草不同部位中甘草酸含量分析
• 6.1.1 材料和方法
• 6.1.2 实验结果
• 6.1.3 小结
• 6.2 甘草不同部位Β-香树酯醇合成酶基因表达分析
• 6.2.1 材料和方法
• 6.2.2 实验方法
• 6.2.4 分析与讨论
• 6.3 小结
• 7 结论与讨论
• 7.1 甘草酸形成和基因的相关性
• 7.1.1 ITS序列多态性与甘草酸形成的相关性
• 7.1.2 β-香树酯醇合成酶基因多态性与甘草酸形成的相关性
• 7.2 甘草酸积累与基因的相关性
• 7.2.1 甘草酸积累和ITS序列多态性的相关性
• 7.2.2 甘草酸积累和β-香树酯醇关键酶基因多态性的相关性
• 7.3 甘草酸积累和基因表达的相关性
• 7.4 创新与展望
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历