树舌多糖双向免疫调节作用的研究

论文摘要

从树舌液体深层发酵浸膏中提取的树舌多糖（Ganoderma applanatumpolysaccharides,GAP），具有提高免疫力，抗病毒、抗菌消炎、保肝健胃等药理活性。本研究以树舌液体深层发酵浸膏粗多糖（GAP-0）和不同分子量的两种均一多糖（GAP-1分子量30000和GAP-2分子量6600）为材料，以RAW264.7细胞系为实验模型，考察不同树舌多糖单独和有脂多糖（LPS）刺激时，对RAW264.7细胞的免疫调节作用。中性红吞噬实验结果显示，不同浓度的树舌多糖（5μg/ml，25μg/ml，100μg/ml）分别与RAW264.7细胞共同培养24小时，与对照组相比均能促进其吞噬活性（P<0.05），其中吞噬指数以100μg/ml GAP-0（1.37），100μg/ml GAP-1（1.39），5μg/mlGAP-2（1.31）最为显著。Griess实验结果显示各样品还能促进细胞生成NO，且均以100μg/ml浓度最强，分别为16.49μM（GAP-0）、22.73μM（GAP-1）、12.94μM（GAP-2），显著高于对照组的NO（4.38μM, P<0.01）。酶联免疫法（ELISA）检测GAP-0、GAP-1和GAP-2促细胞生成TNF-α、IL-1β、IL-6作用均以100μg/ml效果最高，TNF-α浓度最高分别为164.09、198.91、157.44pg/ml；IL-1β浓度最高分别可达102.04、131.85、81.94pg/ml；IL-6浓度最高分别为80.06、98.91、67.41pg/ml，均显著高于对照组（P<0.01）。三种树舌多糖以GAP-1上调作用最强。信号通路研究结果显示，抗TLR4（2.0μg/ml）抗体对上述三种树舌多糖促进巨噬细胞产生NO、TNF-α、IL-1β、IL-6作用有显著的拮抗作用（P<0.01）；p38MAPK特异性阻断剂SB203580（20μM）和NF-κB特异性阻断剂BAY11-7082（10μM）对这一促进作用也有显著的抑制作用（P<0.01）。1μg/ml LPS与RAW264.7细胞作用24小时后，NO的含量升至35.91μM。上述三种不同浓度的GAP-0，GAP-1，GAP-2与LPS共同作用于RAW264.7细胞，生成的NO浓度显著低于单独的LPS组（P<0.01），并且均以浓度为25μg/ml时下调效果最明显，NO浓度分别仅为21.58μM、18.70μM、11.37μM。LPS还能促进巨噬细胞产生大量的TNF-α（226.46pg/ml）、IL-1β（102.49pg/ml）、IL-6（152.76pg/ml），而GAP-0、GAP-1和GAP-2均能减少诱导的TNF-α、IL-1β、IL-6产生量，25μg/ml GAP-0、GAP-1和GAP-2可使TNF-α生成量减少到153.66、128.67、110.26pg/ml；IL-1β生成量减少到70.16、68.16、48.52pg/ml；IL-6生成量减少到81.28、72.11、49.77pg/ml。三种树舌多糖以GAP-2下调作用最强。信号通路研究结果显示，抗TLR4（2.0μg/ml）抗体对这一下调作用也有显著的拮抗作用（P<0.01）； p38MAPK特异性阻断剂SB203580（20μM）和NF-κB特异性阻断剂BAY11-7082（10μM）对这一下调作用也有显著的抑制作用（P<0.01）。以上研究表明，树舌多糖能激活正常静息状态的巨噬细胞，具有弱的上调NO、TNF-α、IL-1β、IL-6产生的能力，这种作用可能是由于树舌多糖通过TLR4激活巨噬细胞，提高巨噬细胞的吞噬能力，释放大量的NO，从而提高巨噬细胞的溶解能力；激活p38MAPK信号转导通路，活化转录因子NF-κB，后者启动TNF-α、IL-1β、IL-6基因转录，最终导致TNF-α、IL-1β、IL-6的合成与分泌增加，从提高机体的免疫功能。但当细胞处在过度激活状态时，树舌多糖又能下调LPS诱导产生的大量NO、TNF-α、IL-1β、IL-6等炎症介质。这种下调作用是由于树舌多糖干扰LPS与细胞受体结合有关。因此GAP对巨噬细胞的免疫调节作用是双向的，是一种双向免疫调节剂。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 第一章 文献综述
• 1.1 真菌多糖对巨噬细胞的免疫调节及作用机理的研究
• 1.1.1 真菌多糖对巨噬细胞活性的影响
• 1.1.2 巨噬细胞表面的多糖受体
• 1.1.3 多糖与巨噬细胞内的信号转导
• 1.2 真菌多糖在抗炎作用方面的研究
• 1.3 LPS 介导的巨噬细胞炎症反应
• 1.3.1 脂多糖在巨噬细胞表面的受体
• 1.3.2 脂多糖介导的炎症反应通路
• 1.4 树舌多糖研究进展
• 1.5. 研究目的及意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 细胞和样品
• 2.1.2 实验药品及试剂
• 2.1.3 实验试剂的配制
• 2.1.4 实验仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 细胞的培养
• 2.2.2 MTT 法测定细胞活性
• 2.2.3 中性红法检测 RAW264.7 细胞的吞噬活性
• 2.2.4 Griess 法测定 RAW264.7 细胞培养上清中 NO 的含量
• 2.2.5 ELISA 法测定 RAW264.7 细胞培养上清中细胞因子的含量
• 第三章 结果
• 3.1 GAP 对 RAW264.7 细胞功能的影响
• 3.1.1 GAP 对 RAW264.7 细胞状态的影响
• 3.1.2 GAP 对 RAW264.7 细胞吞噬活性的影响
• 3.1.3 GAP 对 RAW264.7 细胞 NO 生成的影响
• 3.1.4 GAP 对 RAW264.7 细胞 TNF-α生成的影响
• 3.1.5 GAP 对 RAW264.7 细胞 IL-1β生成的影响
• 3.1.6 GAP 对 RAW264.7 细胞 IL-6 生成的影响
• 3.1.7 TLR4 抗体对 GAP 促进作用的影响
• 3.1.8 p38MAPK 特异阻断剂对树舌多糖促进作用的影响
• 3.1.9 NF-κB 特异阻断剂对树舌多糖促进作用的影响
• 3.2 树舌多糖对对脂多糖诱导 RAW264.7 过度免疫作用的影响
• 3.2.1 不同浓度 GAP 对 LPS 诱导的 RAW264.7 细胞状态的影响
• 3.2.2 GAP 对 LPS 诱导的 RAW264.7 细胞 NO 生成的影响
• 3.2.3 GAP 对 LPS 诱导的 RAW264.7 细胞 TNF-α生成的影响
• 3.2.4 GAP 对 LPS 诱导的 RAW264.7 细胞 IL-1β生成的影响
• 3.2.5 GAP 对 LPS 诱导的 RAW264.7 细胞 IL-6 生成的影响
• 3.2.6 TLR4 抗体对 GAP 抑制作用的影响
• 3.2.7 p38MAPK 特异阻断剂对树舌多糖抑制作用的影响
• 第四章 讨论
• 4.1 GAP 对细胞吞噬活性的调节作用
• 4.2 GAP 对细胞分泌细胞因子的调节作用
• 4.3 GAP 发挥双向免疫调节的作用机制
• 第五章 结论
• 参考文献
• 作者简介
• 致谢