亚-MIC大环内酯类抗菌药物对临床分离表皮葡萄球菌生物膜形成的影响及机理研究

论文摘要

细菌生物膜（bacterial biofilm）是细菌利用自身分泌的含水聚合物质黏附成团，附着于固体物质表面的具有特殊微结构的细菌群落。生物膜可形成于多种材料表面，也包括机体组织和植入的医疗器械，生物膜细菌具备较高的耐药能力且具有可播散的特点，其引起的感染在临床上常表现为迁延不愈。表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis，S epidermidis）为最常见的凝固酶阴性葡萄球菌（coagulase negative staphylococcus,CNS），常于植入的医疗器械表面形成生物膜，而S epidermidis引起的生物膜感染是目前医疗器械相关感染的主要原因，对其生物膜感染的防治是现今抗感染研究领域的难点和重点之一。近年来的一些研究提示，抗菌药物虽然难以清除生物膜菌，但在亚抑菌浓度subinhibitory concentration，亚-MIC)下，却可能有效干扰生物膜的形成，这为有效预防临床细菌生物膜形成和播散提供了希望。鉴于其具有良好的临床应用前景，亚-MIC抗生素对细菌生物膜形成的调控作用开始受到重视。大环内酯类抗菌药物（Macrolides）在体外亚-MIC浓度下显示了对铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、鸟分枝杆菌Mycobacterium avium)等生物膜形成的抑制作用，受到了较多关注。大环内酯类药物属广谱抗菌药物，在临床广泛应用于β-链球菌、肺炎链球菌、葡萄球菌和肠球菌等病原菌的感染治疗，但其亚-MIC浓度甚至常规治疗浓度是否也对这些病原菌生物膜形成有一定的影响？对此现有的研究提示极少。目前也尚未有研究关于亚-MIC大环内酯类抗菌药物对临床分离Staphylococcus epidermidis生物膜形成的影响。对此进行研究将对进一步了解亚-MIC大环内酯类抗菌药物的生物膜调控机制以及寻找有效防治临床细菌生物膜感染的有效手段均具有一定的科学意义和现实意义。在本研究中，利用微孔测定法考察了1/4 MIC红霉素（erythromycin, EM）对105株红霉素耐药的临床分离S epidermidis生物膜形成的影响，筛选出了21株生物膜受EM显著诱导的菌株，继而考察了三种大环内酯类药物阿奇霉素（azithromycin, AZM）、克拉霉素（clarithromycin, CAM）和红霉素对这21株菌生物膜形成的作用。通过PCR法鉴定105株临床分离S epidermidis的icaA基因型，探讨了亚-MIC大环内酯类药物的作用和icaA基因型的关系，并从中选取出分别为icaA阳性和icaA阴性的菌株Sepidermidis SW029和S epidermidis SW036作进一步的时效和量效研究。在机理研究中以S epidermidis SW029为主要研究对象，首先考察了EM（8mg/L，1/16 MIC）对其生长的影响，其后通过激光共聚焦显微镜以及扫描电子显微镜考察了EM对其初始黏附的影响，并观察了亚-MIC EM作用下S epidermidis SW029细菌生物膜形成的过程。生物膜相关基因icaA, sigB, atlE and sarA的考察以realtime RT-PCR方法进行，在此基础上选取时间点进一步对S epidermidis SW029全基因组表达谱作对比分析，旨在寻找亚-MIC大环内酯类药物的作用靶点和可能的作用机制。在研究的最后部分，我们尝试建立了一种新的细菌生物膜感染的体内模型。研究的主要结果如下：1. 1/4 MIC EM显示了对20%临床分离S epidermidis生物膜形成的显著诱导作用，令人关注的是另两种大环内酯类药物AZM和CAM显示了对这20%菌株相似的诱导作用，诱导的幅度与EM显示了相关性（R2均为0.91）。提示大环内酯类药物可诱导部分临床分离S epidermidis菌株的生物膜形成，同时研究显示生物膜的这种诱导作用和icaA基因型之间没有必然的联系。2. icaA基因型鉴定结果显示基因阳性的菌株生物膜形成能力显著强于icaA阴性的菌株，但EM的生物膜诱导作用与icaA基因型无关；亚-MIC EM没有显示对金黄色葡萄球菌的诱导作用，提示其作用对S epidermidis具特异性。3.所有三个浓度（1/4，1/16，1/64 MIC）的AZM, CAM和EM显示了对S epidermidisSW029生物膜形成的显著诱导作用，并没有显示出剂量依赖性。药物对S epidermidisSW036的生物膜诱导作用则有明显的剂量依赖性；大环内酯类药物对这两株菌的生物膜诱导作用可持续至48h。4. EM 8mg/L（1/16MIC）在24h内可显著抑制S epidermidis SW029的生长。EM并没有显示对其初始黏附的统计学差异。提示药物的诱导作用可能与细菌初始黏附能力的改变无关。5.以激光共聚焦显微镜和扫描电镜观察细菌生物膜的形成过程，EM 8mg/L组细菌在12h时多糖开始有显著分泌，而同一时间点对照组多糖分泌并不明显，24h两组多糖分泌均有明显增加。至48h，通过扫描电镜观察到EM组的生物膜开始呈现膜状包裹的典型的生物膜性状，于对照组中未发现。6. EM 8mg/L作用6h，icaA, sigB, atlE和sarA基因与对照组相对基因表达比值分别为1.2，2.0，6.2和1.7倍，至24h相对基因表达比值分别为2.8，0.6，2.4和6.9倍。提示atlE的诱导作用可能是生物膜诱导的重要途径，而icaA和sarA的诱导从时间点和作用强度分析可能为继发性的诱导作用。7.全基因组表达谱分析显示，EM 8mg/L使S epidermidis SW029基因表达发生了广泛的变化，有332个基因发生了2倍下调，同时395个基因表达发生了2倍上调，共占所有表达基因的近三分之一，其中一些涉及细菌生长，黏附，细菌外膜的生物合成等生物膜形成相关调节基因，而atlE的诱导作用较为显著，提示atlE基因调节可能是调节机制之一。由于核糖体蛋白的编码基因表达几乎一致受到诱导，我们推测与大环内酯类药物的抗菌机理一致，亚-MIC大环内酯类抗菌药物作用于核糖体并抑制蛋白质合成，但其在较低浓度下仍然能够发挥显著生物膜诱导作用的现象提示药物与核糖体蛋白的相互作用可能存在结合位点或基因突变的差异。因此进一步对核糖体蛋白及基因的研究可能有助于研究亚-MIC药物发挥调节作用的机制。8.通过Babl/c小鼠建立了一种的新的生物膜感染模型。经方法学研究，该模型具有微创，操作性强，评价直观等优点，并且模型可在一定程度上客观反应考察菌株生物膜形成能力的差异，但模型建立后的生物膜感染程度的评价方法在特异性上还存在缺陷，还需进一步完善。本课题研究结果提示，大环内酯类药物在亚-MIC浓度下，对临床分离S epidermidis的生物膜形成总体上存在诱导的趋势，其机理可能是亚-MIC大环内酯类药物通过抑制核糖体蛋白质合成，继而影响生物膜相关基因的表达诱导生物膜形成，其中atlE可能起到了重要的作用。近年来葡萄球菌的耐药率逐年升高，同时大环内酯类药物在临床又使用广泛，而亚-MIC是一个相对量的概念，耐药菌感染的患者所接受治疗的抗菌药物浓度通常只能达到亚-MIC水平。因此本研究结果警示，对那些有/潜在S epidermidis生物膜感染的患者，接受大环内酯类药物治疗可能存在一定的风险。人类利用抗菌药物（作为杀菌剂或抑菌剂）杀灭或抑制细菌生长，但究其本源，抗菌药物来源于由细菌合成并释放的小分子活性物质，其可为细菌感知并参与调控一系列生命行为，其中也包括细菌生物膜的形成。鉴于目前对亚-MIC抗菌药物对细菌生物膜的调控还知之甚少，尚有许多未知的作用存在，因此，进行大量相关的实验室研究，可为临床抗菌药物在使用时能够趋利避害，合理应用提供有价值的参考，也可通过细菌生物膜相关调控机制的研究，为更加有效地防控细菌生物膜感染提供有力的帮助。

论文目录

• 英文缩写索引
• 英文摘要
• 中文摘要
• 论文正文 亚-MIC 大环内酯类抗菌药物对临床分离表皮葡萄球菌生物膜形成的影响及机理研究
• 前言
• 第一部分 体外亚-MIC 大环内酯类抗菌药物对临床分离葡萄球菌生物膜形成的筛选
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 体外亚-MIC 大环内酯类药物诱导表皮葡萄球菌生物膜形成的机理研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第三部分 利用微创方法建立体内细菌生物膜感染模型研究亚-MIC 阿奇霉素对Sepidermidis SW029 生物膜形成的影响
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 全文小结
• 致谢
• 参考文献
• 文献综述 亚抑菌浓度抗生素对细菌生物膜形成的影响
• 参考文献
• 攻读博士期间发表的课题相关论文
• 英文论著