一株高产纳豆激酶的纳豆枯草芽孢杆菌的研究

论文摘要

纳豆，是指以大豆为原料经纳豆枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis natto）发酵而成盛行于日本的传统发酵大豆食品。纳豆周围的黏性物质聚谷氨酸中含有一些具有生理活性的物质如纳豆激酶（Nattokinase，NK）、纳豆菌、血管紧张肽转化酶抑制剂、维生素K2、吡啶二羧酸、异黄酮等，具有抗肿瘤、溶血栓、降血压、抗氧化性、防止骨质疏松、抑菌等多种保健功能。纳豆枯草芽孢杆菌是从日本传统食品中分离出来的菌种，其原始菌株与枯草芽孢杆菌相同，是枯草芽孢杆菌的一个亚种。纳豆激酶是由纳豆枯草杆菌产生分泌到细胞外的具有强烈溶栓功能的碱性丝氨酸蛋白酶，是一种枯草杆菌蛋白酶。纳豆激酶具有很强的纤溶活性和良好的溶栓能力，可用于治疗和预防心血管疾病。纳豆激酶来源于传统发酵食品，无副作用，安全性高，符合治疗血栓病的药品和功能性保健食品基料的要求。本文主要进行了纳豆枯草芽孢杆菌菌株的筛选、纳豆激酶酶活的测定方法的探索、纳豆固体发酵产纳豆激酶的条件优化、纳豆的安全性评价、纳豆的活性物质等方面的研究，为进一步的研究和功能性保健食品的开发提供理论依据。首先利用芽孢的耐热性和纳豆枯草芽孢杆菌产的丝氨酸蛋白酶――纳豆激酶可水解酪素和酪蛋白而形成透明圈，从市售纳豆菌中筛选出2株纳豆枯草芽孢杆菌菌株NB-7和NB-8。经革兰氏染色与已知的纳豆枯草芽孢杆菌进行显微形态比较，同时进行生理生化鉴定实验以及进行平板形态特征观察并参照《伯杰氏细菌鉴定手册》（第八版）进行对比。基本确认这两株菌株均为纳豆枯草芽孢杆菌。本文探索了利用枯草杆菌蛋白酶活力测定法来测定纳豆激酶活力，来寻找廉价高效的测定豆激酶方法来代替纤维蛋白平板法，建立纤维蛋白平板法与Folin-酚法测纳豆激酶酶活的相关性。实验证明纤维蛋白平板法与Folin-酚法的相关性较高，两者的相关性方程为：Y（纳豆激酶酶活）=0.9433X（蛋白酶酶活）—30.891，相关系数R2=0.9906。通过对生科院微生物教研室提供的6株菌株和本实验筛选出的两株菌株进行固体发酵（其产品后简称为纳豆），测定各菌株的纳豆激酶的活性，确定NB-7为纳豆固体发酵的研究菌株。通过对纳豆枯草芽孢杆菌生长曲线的绘制，得到最佳的接种种龄为20h。通过单因素筛选考察了物料厚度、碳源、生长因子添加物、无机盐、物料含水量、接种量、后熟时间对发酵产纳豆激酶的影响。进一步通过利用designexpert7.0软件的Box-Behnken设计实验，考察葡萄糖、酵母粉、MgSO4、培养时间4个因素对纳豆枯草芽孢杆菌固体发酵产酶的影响，优化并得到了这4个因素的最佳水平组合。得到纳豆固体发酵最佳培养基和培养条件是：物料厚度为2cm、碳源葡萄糖6%、生长因子添加物酵母粉1.65%、无机盐MgSO40.3%、物料含水量60%、接种量6%、发酵时间38.85h、后熟时间1d，理论最高酶活可达2797.17IU/g。纳豆的安全性评价是通过对小鼠灌胃给药（纳豆粉浓稠液）进行急性毒理试验，给药后观察7d，未见小鼠死亡和其他明显毒性反应症状；主要系统和器官没有中毒现象。实验结果显示小鼠最大耐受量倍数为119.2758倍，而根据《保健食品安全性毒理学评价规范》急性毒性实验要求，超过100倍剂量无急性毒性反应则表示可安全食用。急性毒性实验结果说明该纳豆粉是安全无毒的。利用高效液相色谱--质谱联初步研究了生黄豆粉、灭菌黄豆粉和纳豆粉三者之间异黄酮形式种类的变化，同时考察了冷冻干燥和烘干干燥对灭菌黄豆粉和纳豆粉的异黄酮形式的影响。结果：纳豆粉在保留时间8.9min和12.4min处出现未知峰，其含量明显比没有发酵的黄豆粉高很多，同时其在保留时间为2.1min处的峰值变的很低；冷冻干燥的纳豆粉在15.83min出现未知峰，而在烘干干燥的纳豆粉中未见其峰；热处理对异黄酮不同形式的含量变化也有所影响，生黄豆粉在保留时间为24.6min和26.3min处的峰值较低，而经过热处理的黄豆粉以及纳豆粉在这两个保留时间的峰值明显高于生黄豆粉的峰值。结果说明纳豆枯草芽孢杆菌在利用黄豆进行固体发酵时对黄豆中的异黄酮形式的变化有影响。采用同时蒸馏萃取法和气质联用（GC-MS）的方法，初步研究了生黄豆粉、灭菌黄豆粉和纳豆粉的挥发性物质。纳豆中挥发性成分相对含量较高的有吲哚37.85%、苯乙醇16.88%。对纳豆进行了挥发性化合物的研究与分析，共鉴定出了挥发性化合物40种，其中包括醇、酸、酯、醛、酮、酚、吡嗪、吠喃等以及其它化合物。而生黄豆粉的挥发性物质只有萘和二叔丁基对甲酚两种，其中二叔丁基对甲酚占99%。经121℃灭菌热处理的黄豆，新增了1-辛烯-3-醇、苯乙醇、2-甲氧基-4-乙烯基苯酚3种挥发性物质，二叔丁基对甲酚仍达87.12%。结果表明纳豆中的挥发性物质主要是黄豆经过纳豆枯草芽孢杆菌发酵而来的，高浓度的吲哚具有强烈的粪臭味，扩散力强而持久因此说明纳豆呈现的特殊气味很可能是由吲哚引起的。在以上实验基础上，生产出康肽纳豆胶囊，确定了生产工艺，制定了企业标准：Q/NZFT0004S-2009，在宁夏回族自治区报批了强化营养食品批号，宁卫食证字2009第640100SQ002号，并进行了工业化生产。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 1 文献综述
• 1.1 纳豆简介
• 1.2 纳豆枯草芽孢杆菌
• 1.3 纳豆激酶的研究进展
• 1.3.1 纳豆激酶的结构
• 1.3.2 纳豆激酶的理化特性
• 1.3.3 血栓性疾病及形成机制和溶栓类药物
• 1.3.4 纳豆激酶的溶栓机制
• 1.3.5 纳豆激酶的分离纯化
• 1.3.6 纳豆激酶活性的测定方法
• 1.3.7 纳豆激酶发酵的研究
• 1.3.8 纳豆激酶基因工程研究进展
• 1.3.9 纳豆和纳豆激酶的开发应用现状及前景
• 1.4 纳豆医疗保健功能
• 1.4.1 溶血栓--防治心脑血管疾病
• 1.4.2 防癌、抗癌
• 1.4.3 抗菌作用
• 1.4.4 调节肠功能
• 1.4.5 抗氧化性
• 1.4.6 预防骨质疏松症和促凝血作用
• 1.4.7 降低胆固醇的作用
• 1.4.8 降血压
• 1.4.9 防治糖尿病作用
• 1.4.10 其他营养、医疗功效
• 2 引言
• 2.1 立题目的和意义
• 2.2 研究内容和方法
• 3 材料与方法
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 菌种来源
• 3.1.2 培养基和溶液
• 3.1.3 主要试剂
• 3.1.4 主要仪器与设备
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 纳豆枯草芽孢杆菌的分离与鉴定
• 3.2.2 纳豆制备
• 3.2.3 种子液的制备
• 3.2.4 粗酶液的制备
• 3.2.5 纳豆激酶活性测定方法
• 3.2.6 纳豆固体发酵培养基及培养条件优化
• 3.2.7 纳豆粉及灭菌黄豆粉和生黄豆粉的制备
• 3.2.8 异黄酮的提取
• 3.2.9 异黄酮的高效液相色谱分析条件和质谱分析
• 3.2.10 挥发性成分的提取
• 3.2.11 GC-MS检测分析
• 3.2.12 小鼠的急性毒理试验
• 3.2.13 纳豆粉主要成分测定
• 4 结果与分析
• 4.1 纳豆枯草芽孢杆菌的分离与鉴定
• 4.1.1 纳豆枯草芽孢杆菌的分离
• 4.1.2 纳豆枯草芽孢杆菌的鉴定和分类学地位
• 4.2 纳豆固体发酵条件的优化
• 4.2.1 纳豆枯草芽孢杆菌菌株确定及其生长曲线绘制
• 4.2.2 纳豆激酶的测定
• 4.2.3 物料厚度对发酵产纳豆激酶的影响
• 4.2.4 不同碳源对发酵产纳豆激酶的影响
• 4.2.5 不同生长因子添加物对发酵产纳豆激酶的影响
• 4.2.6 不同无机盐对发酵产纳豆激酶的影响
• 4.2.7 不同含水量对发酵产纳豆激酶的影响
• 4.2.8 不同接种量对发酵产纳豆激酶的影响
• 4.2.9 后熟时间对发酵产纳豆激酶的影响
• 4.2.10 固体发酵产纳豆激酶重要因素的响应面优化
• 4.3 纳豆活性物质的初步研究
• 4.3.1 纳豆发酵中的异黄酮的变化
• 4.3.2 纳豆挥发性物质的初步研究
• 4.4 康肽纳豆胶囊产品开发
• 4.4.1 康肽纳豆胶囊的毒理实验
• 4.4.2 康肽纳豆胶囊主要成分测定
• 4.4.3 生产工艺的确立
• 4.4.4 质量标准的建立
• 5 讨论
• 5.1 纳豆枯草芽孢杆菌的分离与鉴定
• 5.2 纳豆激酶的测定
• 5.3 纳豆固体发酵条件的优化
• 5.4 纳豆中的异黄酮研究
• 5.5 纳豆挥发性物质的初步研究
• 5.6 康肽纳豆胶囊的毒理实验
• 5.7 康肽纳豆胶囊生产工艺和质量标准的确立
• 6 结论
• 6.1 纳豆枯草芽孢杆菌菌株的筛选
• 6.2 纳豆激酶酶活的测定方法的探索
• 6.3 固体发酵产纳豆激酶的条件优化
• 6.4 纳豆中的异黄酮研究
• 6.5 纳豆挥发性成分的研究
• 6.6 康肽纳豆胶囊的毒理实验
• 6.7 康肽纳豆胶囊生产工艺和质量标准的确立
• 参考文献
• 致谢
• 个人简介
• 附件 1 康肽纳豆胶囊企业标准
• 附件 2 食品卫生许可证和中国商品条码系统成员证书