人可溶性转化生长因子βⅡ型受体重组腺病毒表达载体的构建

论文摘要

研究背景和目的糖尿病肾病（DN）是糖尿病全身性微血管并发症之一，也是导致终末期肾病的主要因素。在高血糖条件下，肾小球系膜区细胞外基质（ECM）成分合成和分解代谢的紊乱直接导致了糖尿病肾病的发生和发展。众多研究表明过度表达的转化生长因子-β（TGF-β）的活性介导了高血糖对肾脏的作用，且可能是DN发展的主要决定因素。在高血糖环境中抑制或下调TGF-β信号的治疗策略为我们提供了一个抑制DN发生、发展的方法。可溶性TGF-βⅡ型受体（sTβRⅡ）为TGF-βⅡ型受体胞外段，能与TGF-βRⅡ竞争性结合TGF-β，阻断其信号转导通路，从而抑制TGF-β的生物学活性，改善肾功能。为更好地揭示在高血糖环境中应用sTβRⅡ对TGF-β活性、肾小管间质细胞增殖、细胞外基质积聚及组织纤维化的抑制作用，并探讨利用sTβRⅡ基因转染防治DN的可能性，本实验构建了sTβRⅡ重组腺病毒载体，为进一步的研究奠定基础。实验设讦和方法以姚航平研究员提供的sTβRⅡ质粒为模板，以Platinum酶扩增含SalⅠ/XhoⅠ酶切位点的sTβRⅡ基因序列，然后与TA质粒（pMD19-T simple）连接后进行鉴定。通过SalⅠ和XhoⅠ双酶切TA-sTβRⅡ质粒和PSI空载体（腺病毒穿梭载体），纯化、回收后由T4 DNA连接酶连接过夜，并转化入DH5α感受态细菌中，37℃孵育过夜。通过PCR和双酶切鉴定挑取阳性克隆（PSI-sTβRⅡ）。将正确质粒用PmeⅠ酶切线性化后割胶纯化回收，采用电转化的方法将含sTβRⅡ的穿梭载体转入BJ5183-AD-1感受态细菌中，涂板（卡那霉素抗性）后37℃孵育过夜。挑取克隆扩增，抽提质粒并经PCR、酶切鉴定。扩增鉴定正确的腺病毒载体质粒，用PacⅠ酶切纯化后，应用MBS转染试剂盒将质粒转入50％-70％融合的AD-293细胞中。当出现细胞病变效应时收集细胞及培养上清，-70℃-37℃反复冻融3次，剧烈振荡后离心收集上清，-70℃备用。用原代病毒上清继续感染AD-293细胞，以形成第二代病毒，并观察荧光细胞数，进行Western-blot检测和重组蛋白对TGFβ1的拮抗活性的检测。实验结果1、获得人sTβRⅡ基因片段及TA-sTβRⅡ质粒。利用Platinum酶扩增出含SalⅠ/XhoⅠ酶切位点的sTβRⅡ序列，与TA质粒连接后转化入DH5α获得TA-sTβRⅡ质粒，PCR和酶切产物于1.2％琼脂糖凝胶电泳显示片段在500bp左右。测序结果表明序列正确。2、成功构建PSC-IRES-hrGFP-1-sTβRⅡ（以下简称PSI-sTβRⅡ）穿梭载体质粒双酶切后的sTβRⅡ片段和PSI进行连接，获得PSI-sTβRⅡ，经PCR和双酶切后电泳显示有500bp左右的条带。3、成功构建人sTβRⅡ重组腺病毒质粒（AD-sTβRⅡ）PSI-sTβRⅡ经电转化入BJ5183-AD-1细菌中后获得AD-sTβRⅡ质粒，经PCR和双酶切后电泳显示有500bp左右的条带。4、重组腺病毒质粒在AD-293细胞中包装及第二代病毒感染结果重组腺病毒质粒用MBS转染试剂盒将其转入AD-293细胞中，至细胞培养第13天，90％的AD-293细胞出现病变效应，收集细胞及培养上清。-70℃-37℃反复冻融、振荡、离心后取上清感染AD-293细胞，在荧光倒置显微镜下观察有无荧光细胞，并再次收集细胞与病毒。出现荧光细胞、Western-blot检测出现特异性条带和重组蛋白拮抗TGFβ1对MvlLu细胞的生长抑制作用，证明包装病毒为有活性的病毒。结论1、成功构建了表达STβRⅡ的重组腺病毒载体AD-sTβRⅡ。2、表达的sTβRⅡ能阻断TGFβ1对MvlLu细胞的增殖抑制作用。

论文目录

• 中文摘要
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• 前言
• 研究方法
• 研究结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 致谢