论文摘要
慢性充血性心力衰竭（简称慢性心衰）是多种心血管疾病的共同终末阶段。多年来研究证实交感神经活动增强是慢性心衰发生发展的重要机制。交感神经过度兴奋不仅是心衰综合征的主要表现,而且与心衰的严重程度和预后不良关系密切。虽然,临床上针对交感神经过度兴奋的治疗措施已被证明对慢性心衰病人是有益的,但心衰时交感神经兴奋性增强的机制还不完全清楚。下丘脑室旁核（PVN）是神经内分泌活动的重要调节中枢,也是调节细胞外液容量和交感神经驱动的关键脑区。近期研究发现心衰大鼠下丘脑室旁核Fra-LI（中枢神经元慢性激活状态的标记物）和促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）免疫双标阳性神经元数量明显增多,CRH释放增加,外周交感神经活动增强,心功能不断恶化;而且众多参与心血管活动调节的活性物质在该区域积聚,提示室旁核CRH神经元的激活与心衰的发生发展密切相关。神经解剖学研究证实,PVN内CRH神经元除投射到正中隆起,调节腺垂体促肾上腺皮质激素的释放,发挥神经内分泌功能外;还有一些CRH神经元直接投射到延髓头端腹外侧区和脊髓灰质中间外侧柱,通过调节这些区域的自主神经核团,发挥调节交感输出的作用。由此我们推测,心衰时室旁核CRH神经元被激活,并参与交感神经活动增强,加重心功能恶化。近期研究提示,心衰时中枢内前列腺素E2（PGE2）和去甲肾上腺素（NE）升高,可能是激活室旁核CRH神经元的两个重要因素。此外,由于室旁核CRH神经元接受来自中枢神经系统缜密的神经支配。这些支配中,除正常情况下起主导作用的GABA能支配外,还有肾上腺素能以及谷氨酸能支配等。而γ-氨基丁酸（GABA）是PVN内主要的抑制性神经递质,谷氨酸和NE是重要的兴奋性神经递质。因此我们推测,心衰时中枢内升高的PGE2和NE可能直接激活室旁核CRH神经元,也可能作用于室旁核神经递质系统进而激活CRH神经元,导致交感神经活动增强。为探明以上推测,本研究首先观察了慢性心衰时PVN内CRH的表达变化以及CRH神经元激活与交感神经活动增强之间的关系。随后,本研究通过侧脑室慢性给予环氧合酶-2抑制剂塞来考昔（CEL）以及选择性αl肾上腺素能受体阻滞剂哌唑嗪（PRA）,对心衰时中枢内升高的PGE2和NE是否为室旁核CRH神经元的激活物进行了验证,并观察了PVN内GABA、谷氨酸和NE及其相应的限速酶谷氨酸脱羧酶（GAD67）和酪氨酸羟化酶（TH）在其中的可能作用。由于气态神经递质一氧化氮（NO）可以通过调节多种神经递质来发挥其交感调节作用,因此,本研究还观察了神经元型一氧化氮合酶（nNOS）在上述病理过程中的可能作用。下丘脑室旁核CRH神经元在心衰发生发展过程中的作用及其机制研究是心衰研究领域的一个新热点,该机制的阐明将有助于心衰治疗的研究。第一部分下丘脑室旁核CRH神经元激活在慢性充血性心力衰竭中的交感兴奋作用目的:观察慢性心衰时PVN内CRH的表达变化,以及CRH神经元的激活与交感神经活动增强之间的关系。方法:实验分两部分。首先,选取SD大鼠,采用冠状动脉左前降支结扎致心肌梗死制备心衰模型,假手术对照只穿线不结扎。所有动物经侧脑室插管连接渗透压泵持续给药4周（假手术对照组和心衰模型组给予空白对照人工脑脊液0.25μl/h,心衰模型给药组给予CRH竞争性抑制剂αh-CRH 15μg/h）。第二,选取体内CRH合成不足的Lewis大鼠与同源纯种Fischer 344大鼠,同样采用冠脉结扎术制备心衰模型和假手术对照,进行对比研究。实验结束时,保证各组至少有12只动物存活。4周后,各组大鼠（SD、Lewis和Fischer）测定血流动力学指标左室舒张末压（LVEDP）和左室内压最大上升和下降速率（±dp/dtmax）评价心功能;测定右心室/体重比（RV/BW）和肺/体重比（lung/BW）反映左心室前负荷变化;电生理记录肾交感神经放电活动（RSNA）,ELISA测定血浆去甲肾上腺素（NE）浓度,作为交感神经兴奋性指标;免疫组织化学染色和western blot测定PVN内CRH的表达,ELISA测定血浆促肾上腺皮质激素（ACTH）含量,评价室旁核CRH神经元激活情况。结果:（1）SD大鼠:心衰模型组大鼠与假手术对照组相比,PVN内CRH免疫阳性神经元数目和CRH蛋白含量均明显增加（相应地外周血ACTH升高）（p<0.05）,伴有RSNA增强和外周血NE增加（p<0.05）,而且LVEDP、lung/BW和RV/BW增加（p<0.05）,±dp/dtmax降低（p<0.05）;心力衰竭模型术后侧脑室慢性给予αh-CRH可明显逆转以上各种表现（p<0.05）。（2）Fisher大鼠:心衰模型组和相应假手术对照相比,PVN内CRH神经元活性增强（CRH免疫阳性神经元数目和蛋白含量均明显增加,血浆内ACTH升高）（p<0.05）,交感神经活动增强（RSNA增强,外周血NE升高）（p<0.05）,LVEDP和RV/BW、lung/BW增加（p<0.05）,±dp/dtmax下降（p<0.05）。（3）Lewis大鼠:心衰模型组和相应假手术对照相比,PVN内CRH免疫阳性神经元数目和蛋白含量虽略有增加,但尚不具有统计学意义（p>0.05）;外周血ACTH含量的变化与室旁核内CRH含量改变相一致（p>0.05）;RSNA没有明显增强（p>0.05）,血浆内NE水平也没有显著增加（p>0.05）;心功能得以很好保持（LVEDP和±dp/dtmax及RV/BW、lung/BW改变均不明显）（p>0.05）。结论:慢性心衰时,下丘脑室旁核CRH神经元被激活,并可增强外周交感神经活动,加重心功能恶化。第二部分慢性充血性心力衰竭时中枢前列腺素E2与下丘脑室旁核CRH神经元激活的关系目的:验证慢性心衰时,中枢内升高的PGE2是否为PVN内CRH神经元的激活因素,并探讨可能的激活机制。方法:选取SD大鼠,采用冠脉结扎术制备心衰模型,假手术对照只穿线不结扎。所有动物经侧脑室插管连接渗透压泵持续给药4周（假手术对照组和心衰模型组给予空白对照人工脑脊液0.25μl/h,心衰模型给药组给予环氧合酶-2抑制剂CEL 20μg/h）。4周后,各组大鼠血流动力学测定LVEDP和±dp/dtmax;测定RV/BW和lung/BW;电生理记录RSNA,ELISA测定血浆ACTH和NE及脑脊液PGE2浓度;免疫组织化学染色和western blot测定PVN内CRH、TH、GAD67和nNOS的表达;高效液相色谱（HPLC）测定PVN内NE、谷氨酸和GABA含量。结果:（1）与假手术对照组相比,心衰模型组大鼠脑脊液内PGE2含量明显增加（p<0.05）;PVN内CRH免疫阳性神经元数目明显增多,CRH蛋白含量明显增加,外周血ACTH升高（p<0.05）;并且RSNA增强,外周血NE升高（p<0.05）;LVEDP、RV/BW和lung/BW明显增加,±dp/dtmax明显下降（p<0.05）。侧脑室给予环氧合酶-2抑制剂CEL后,心衰大鼠脑脊液内PGE2明显下降,PVN内CRH免疫阳性神经元数目和蛋白含量均有所降低,外周血ACTH水平下降（p<0.05）;同时RSNA和血浆NE降低（p<0.05）;LVEDP、RV/BW和lung/BW有所下降,±dp/dtmax有所升高（p<0.05）。（2）与假手术对照组相比,心衰模型组大鼠PVN内谷氨酸、NE和TH含量较高,GABA、GAD67和nNOS较低（p<0.05）;侧脑室慢性给予CEL后,PVN内谷氨酸、NE和TH下降,GABA、GAD67和nNOS增加（p<0.05）。结论:慢性心衰时,中枢内升高的PGE2可以激活下丘脑室旁核CRH神经元参与交感神经活动增强,而该作用可能通过改变下丘脑室旁核神经递质系统来实现。第三部分慢性充血性心力衰竭时中枢去甲肾上腺素与下丘脑室旁核CRH神经元激活的关系目的:验证慢性心衰时,中枢内升高的NE是否为PVN内CRH神经元的激活因素,并探讨可能的激活机制。方法:SD大鼠,心衰模型及给药方法同第二部分。实验动物分三组:假手术对照组和心衰模型组给予空白对照人工脑脊液0.25μl/h,心衰模型给药组给予选择性αl受体阻滞剂PRA 10nmol/h。同样,4周后测定心功能指标LVEDP和±dp/dtmax;左室前负荷指标RV/BW和lung/BW;交感神经兴奋性指标RSNA和血浆NE。另外,ELISA测定血浆ACTH浓度;免疫组织化学染色和western blot测定PVN内CRH、TH、GAD67和nNOS的表达;高效液相色谱测定PVN内NE、谷氨酸和GABA含量。结果:（1）与假手术对照组相比,心衰模型组大鼠PVN内NE含量及其限速酶TH表达明显增加,CRH免疫阳性神经元数目和蛋白含量明显增加,外周血ACTH升高（p<0.05）;伴有RSNA增强和外周血NE升高（p<0.05）;LVEDP、RV/BW和lung/BW增加,±dp/dtmax明显下降（p<0.05）。侧脑室慢性给予PRA后,PVN内CRH免疫阳性神经元数目明显减少,CRH蛋白含量降低,外周血ACTH水平下降（p<0.05）;而且RSNA减弱,血浆NE降低（p<0.05）;LVEDP、RV/BW和lung/BW下降,±dp/dtmax升高（p<0.05）。（2）与假手术对照组相比,心衰模型组大鼠PVN内谷氨酸浓度增加,GABA、nNOS和GAD67含量下降（p<0.05）;侧脑室慢性给予PRA后,PVN内谷氨酸下降,GABA、nNOS和GAD67有所增加（p<0.05）。结论:慢性心衰时,中枢内特别是下丘脑室旁核升高的NE可以激活室旁核CRH神经元参与交感神经活动增强,而该作用也可能通过改变下丘脑室旁核神经递质系统来实现。
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