莲藕多酚氧化酶基因的克隆与表达分析

论文摘要

藕莲为莲（Nelumbo nucifera Gaertn. ssp. nucifera）三种类型之一,其地下茎莲藕在12种水生蔬菜中栽培面积最大,同时也是我国销售量最大的26种蔬菜之一。莲藕是药食同源性且具有较高营养价值的食品。研究表明莲具有降脂降压、抗氧化、抗衰老、镇静作用、抑制脂肪肝及抑菌等药理作用,具有很高的药用价值。但因莲藕（或莲菜）表皮薄,含水量极高,在加工贮藏过程中普遍存在失水萎蔫、褐变等问题,导致商品性下降,鲜食货架期短,长途运输困难,严重影响了莲藕鲜食和加工产品的出口创汇。研究发现,多酚氧化酶（PPO）是导致莲藕褐变的关键酶之一。本研究采用RT-PCR、RACE技术从莲藕茎尖中克隆多酚氧化酶基因全长（Genbank登陆号为HQ380894）,并利用半定量RT-PCR检测了该基因在藕莲不同组织中的表达情况,以期掌握该酶基因序列信息及其遗传背景,实现贮藏保鲜产品的长期贮存和加工产品的品质遗传改良奠定基础。主要试验结果如下:1建立莲藕RNA的提取方法提取缓冲液主要成分为2%（W/V）CTAB,0.5g/L亚精胺,2% PVP（W/V）,pH 8.0 Tris-HCl和EDTA溶液,并加入巯基乙醇使其终浓度为2%。样品磨成粉末状溶解在提取液后,采用氯仿抽提两次,在RNA的粗提液中加入4:1体积LiCl,-20℃过夜,用氯仿抽提一次,加入2倍体积的无水乙醇,-80℃放置2h,离心去上清,用DEPC水溶解RNA沉淀。该方法可以有效的去除莲藕中的酚类及多糖等杂质,获得纯净、完整的RNA样品,直接用于后续的半定量分析及RACE反应。2采用RT-PCR、RACE技术克隆莲藕茎尖PPO基因的编码区及全长利用RT-PCR和RACE技术从莲藕茎尖中克隆到多酚氧化酶基因,其cDNA全长2074 bp,完整的编码框为1503 bp,编码501个氨基酸,5’端有160 bp非编码区,3’端有411 bp非编码区（Genbank登陆号为HQ380894）。采用生物信息学方法发现该蛋白分子量约为56.8 kD,PI为8.60,具典型的酪氨酸家族结构域,无信号肽结构,但有跨膜螺旋的亲水性蛋白,α-螺旋和β-折叠分散于整个多肽链中。将核苷酸序列的比对结果绘制进化树,在亲缘关系上,从莲藕茎尖获得的PPO基因与同种莲序列PPO （Gen bank登录号为FJ999635,但未见文章报道）同源性高达99%。与其他物种同源性较低。3 PPO在莲藕不同组织中的表达半定量RT-PCR结果显示,该基因在莲藕茎尖、幼叶、莲藕鲜切片、花瓣、茎杆五种组织中均有表达,相对表达量分别为2.659、2.419、2.02、1.797、1.654,即莲藕茎尖>幼叶>莲藕鲜切片>花瓣>茎杆。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.
• 1.1 莲藕概况
• 1.2 营养价值
• 1.3 药用价值
• 1.4 多酚氧化酶的特性
• 1.4.1 PPO 的生理作用
• 1.4.2 PPO 结构特性
• 1.4.2.1 多基因家族性
• 1.4.2.2 序列保守性
• 1.4.2.3 PPO 的分子结构
• 1.4.2.4 PPO 的生化特性
• 1.4.3 时空表达特异性
• 1.5 抑制PPO 活性的研究进展
• 1.5.1 物理方法
• 1.5.1.1 控制温度法
• 1.5.1.2 高压处理
• 1.5.1.3 电场处理
• 1.5.1.4 气调包装
• 1.5.1.5 可食性涂膜
• 1.5.2 化学方法
• 1.5.2.1 还原剂
• 1.5.2.2 酸化剂
• 1.5.2.3 螯合剂
• 1.5.2.4 酶抑制剂
• 1.5.2.5 巯基化合物
• 1.5.3 生物学方法
• 1.5.3.1 植物提取物
• 1.5.3.2 酶法
• 1.5.3.3 基因技术
• 1.6 发展趋势
• 1.7 RACE 技术
• 2 研究背景
• 3 研究内容与技术路线
• 3.1 研究内容
• 3.1.1 莲藕不同组织总RNA 的提取方法的确定
• 3.1.2 莲藕茎尖PPO 基因的克隆及序列分析
• 3.1.3 莲藕PPO 基因的表达特性
• 3.2 技术路线
• 第二章 研究方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株及试剂
• 2.1.3 试剂盒和Maker
• 2.1.4 引物合成与测序
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 cDNA 第一条链的合成
• 2.2.2 以cDNA 为模板PCR 扩增
• 2.2.3 RACE
• 2.2.3.1 5' or 3'-RACE-Ready cDNA 的制备
• 2.2.3.2 PCR 扩增
• 2.2.4 胶回收纯化DNA
• 2.2.5 目的片段与PGM-T-vector 的连接
• 2 法——大肠杆菌DH-5α感受态细胞的制备'>2.2.6 CaCl₂法——大肠杆菌DH-5α感受态细胞的制备
• 2.2.7 连接产物的转化与蓝白斑筛选
• 第三章 莲藕不同组织总RNA 提取方法的确定
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 提取莲藕RNA 的方法
• 3.1.2.1 Trizol 法
• 3.1.2.2 RNAisoTM for poLysaccharide-rich pLant tissue 试剂盒提取莲藕 RNA
• 3.1.2.3 多糖多酚植物总RNA 快速提取试剂盒（Biotake）提取莲藕RNA
• 3.1.2.4 CTAB-LiCL 法提取莲藕 RNA
• 3.1.3 电泳分析
• 3.1.4 总RNA 含量和纯度的测定
• 3.2 结果与分析
• 3.3 讨论
• 第四章 莲藕茎尖多酚氧化酶基因的克隆
• 4.1 试验材料
• 4.1.1 植物材料
• 4.1.2 试剂盒
• 4.2 试验方法
• 4.2.1 莲藕茎尖总RNA 的提取
• 4.2.2 莲藕茎尖多酚氧化酶保守区cDNA 的克隆
• 4.2.2.1 引物设计
• 4.2.2.2 莲藕茎尖多酚氧化酶保守区cDNA 的RT-PCR 扩增
• 4.2.2.3 PCR 产物的回收
• 4.2.2.4 连接与转化
• 4.2.2.5 测序与序列分析
• 4.2.3 莲藕茎尖PPO cDNA 序列的5'RACE 扩增
• 4.2.3.1 引物设计和合成
• 4.2.3.2 莲藕PPO 基因5' RACE 扩增
• 4.2.3.3 目的片段的回收、连接、转化及蓝白斑筛选
• 4.2.3.4 测序及序列分析
• 4.2.4 莲藕茎尖PPO cDNA 序列的3'RACE 扩增
• 4.2.4.1 引物设计和合成
• 4.2.4.2 莲藕PPO 基因3'RACE 扩增
• 4.2.4.3 目的片段的回收、连接、转化及蓝白斑筛选
• 4.2.4.4 测序及序列分析
• 4.2.5 测序结果的生物信息学分析
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 莲藕部分序列的获得
• 4.3.2 莲藕PPO 5' RACE 及3' RACE 克隆及序列分析
• 4.3.3 莲藕PPO 基因编码的蛋白质结构分析
• 4.4 讨论
• 第五章 莲藕多酚氧化酶基因的表达特性
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 方法
• 5.1.2.1 提取莲藕不同组织的RNA
• 5.1.2.2 合成第一条链cDNA
• 5.1.2.3 引物设计
• 5.1.2.4 莲藕PPO 基因及内参基因半定量RT-PCR 循环数的确定
• 5.1.2.5 相对表达含量测定
• 5.1.2.6 数据分析
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 莲藕各组织RNA 的提取
• 5.2.2 半定量循环数的确定
• 5.2.3 相对表达含量测定结果
• 5.3 讨论
• 第六章 总结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介