西农萨能羊TIP47基因的克隆分析与RNA干扰研究

论文摘要

47KD尾部相互作用蛋白（tail-interacting protein 47KD,又称甘露醇-6-磷酸受体结合蛋白1或6-磷酸甘露糖受体靶蛋白,缩写为TIP47、M6PRBP1、PP17或M6PBP）,是PAT家族成员之一,其与脂滴（lipid droplets,LD）的形成及代谢有密切的关系。本研究利用反转录RT-PCR和RACE技术,克隆得到西农萨能羊TIP47基因的完整cDNA序列,采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）技术检测了该基因在西农萨能羊12个组织中的表达水平;通过构建腺病毒RNA干扰载体,在奶山羊乳腺上皮细胞中初步探索TIP47基因的功能;对油酸在奶山羊乳腺上皮细胞中对TIP47基因的表达调控进行了初步研究。获得以下主要研究结果:1.得到了山羊TIP47基因cDNA全长序列,为1906 bp（GenBank收录号为:HQ846827）,包括5’UTR 82 bp,CDS 1 314 bp,和3’UTR 510 bp,共编码437个氨基酸。经核苷酸和氨基酸序列分析发现,山羊TIP47与GenBank中牛（Bos taurus）、人（Homo sapiens）、小鼠（Mus musculus）和猪（Sus scrofa） TIP47基因的相似性较高,其中,核苷酸相似性分别为97%、83%、74%和89%,氨基酸的相似性分别为98%、82%、73%和89%;蛋白质结构分析后,TIP47蛋白质的分子量为47.36 KDa,等电点为5.74;其N端存在典型的保守结构域PAT域。2. RT-qPCR技术对TIP47基因进行奶山羊不同组织表达水平检测发现,乳腺、皮下脂肪、心脏、脾脏、肺脏、肌肉（前胸）、肾脏、瘤胃、小肠、肝脏、垂体及卵巢十二个组织中均有TIP47基因的mRNA,其中乳腺组织中表达水平最高,且明显高于其它组织,脾脏、肺脏次之,肌肉组织表达水平最低。3.成功将针对TIP47基因的三对shRNA构建到pENTR/CMV-GFP/U6穿梭载体上,构建了pDsRed1-C1-TIP47红色荧光蛋白载体并筛选到2条相对有效的shRNA序列,构建针对TIP47基因特异性的shRNA腺病毒干扰载体,在HEK 293细胞中进行包装和扩繁后得到的第四代病毒液的滴度为108 U/mL。在乳腺上皮细胞中测定MOI=200,RT-qPCR检测发现TIP47表达得到有效抑制,并使FASN和HSL的mRNA表达显著上调,ATGL mRNA表达下调。4.油红O染色发现油酸处理奶山羊乳腺上皮细胞可有效促进细胞中脂质的积累,RT-qPCR检测发现油酸对TIP47 mRNA表达的调节随时间表现一定的变化规律,可显著促进HSL mRNA的表达,并抑制了ADRP mRNA的表达。综上所述,本研究从西农萨能羊乳腺组织中克隆得到了TIP47基因完整的cDNA全长序列,与牛、人、小鼠和猪的TIP47基因的核苷酸和氨基酸序列同源性较高,蛋白质结构中存在典型的保守结构域; TIP47基因在奶山羊乳腺组织中的表达水平最高,肌肉组织最低。腺病毒介导的RNA干扰导致TIP47基因的表达量显著降低,FASN和HSL基因表达上调,ATGL基因表达下调。油酸处理乳腺上皮细胞后TIP47 mRNA的表达呈现规律性变化,并影响相关基因的表达。本研究为TIP47基因的功能研究等提供了实验依据。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 乳脂球及被膜研究概述
• 1.2 脂滴的研究进展
• 1.3 PAT 家族蛋白与脂滴代谢
• 1.3.1 Perilipin、ADRP 和TIP47 的概述
• 1.3.2 Perilipin、ADRP 的功能概述
• 1.3.3 TIP47 的结构
• 1.3.4 TIP47 基因的功能
• 1.3.5 TIP47 基因的研究进展
• 1.4 本研究的目的和意义
• 第二章 西农萨能羊乳腺组织TIP47 基因的cDNA 全长克隆及序列分析
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 试验方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 TIP47 基因cDNA 的克隆
• 2.2.2 TIP47 基因的序列分析
• 2.2.3 TIP47 基因的同源性分析
• 2.2.4 TIP47 基因的结构预测分析
• 2.2.5 TIP47 基因的系统进化树分析
• 2.3 讨论
• 2.3.1 关于引物设计
• 2.3.2 关于TIP47 基因
• 2.4 小结
• 第三章 西农萨能羊TIP47 基因的组织表达分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 检测定量引物的可靠性
• 3.2.2 组织表达分析
• 3.3 讨论
• 3.3.1 关于定量引物的设计
• 3.3.2 关于TIP47 基因的组织表达
• 3.4 小结
• 第四章 TIP47 基因的RNA 干扰研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 主要仪器设备
• 4.1.2 主要试验材料
• 4.1.3 靶向TIP47 基因的shRNA 干扰序列的设计与合成
• 4.1.4 pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA 载体构建
• 4.1.5 pDsRed1-C1-TIP47 表达载体的构建
• 4.1.6 shRNA 有效序列的筛选
• 4.1.7 构建重组腺病毒载体并鉴定
• 4.1.8 包装、扩繁腺病毒并测定滴度
• 4.1.9 腺病毒感染乳腺上皮细胞最佳MOI 的测定
• 4.1.10 TIP47 基因的RNA 干扰效率检测
• 4.1.11 PT-qPCR 检测TIP47 基因干扰后对乳腺上皮细胞脂质代谢相关基因的影响
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA 载体的构建
• 4.2.2 pDsRed1-C1-TIP47 载体的构建
• 4.2.3 shRNA 序列的筛选
• 4.2.4 构建重组腺病毒载体并进行鉴定
• 4.2.5 腺病毒的包装、扩繁及滴度测定
• 4.2.6 确定最佳感染复数MOI（Multiplicity Of Infection）
• 4.2.7 TIP47 基因RNA 干扰效率的检测
• 4.2.8 TIP47 的RNAi 对其他一些与脂质代谢相关基因的影响
• 4.3 讨论
• 4.3.1 关于试验技术的优化
• 4.3.2 关于TIP47 表达抑制后对脂质代谢相关基因的影响
• 4.4 小结
• 第五章 油酸对西农萨能羊乳腺上皮细胞中脂滴形成和TIP47 基因表达的影响
• 5.1 材料仪器
• 5.1.1 试验材料及试剂
• 5.1.2 主要仪器
• 5.2 试验方法
• 5.2.1 溶液配制
• 5.2.2 油酸处理乳腺上皮细胞
• 5.2.3 油酸处理乳腺上皮细胞的油红O 染色
• 5.2.4 细胞中总RNA 的提取
• 5.2.5 萨能羊乳腺细胞总RNA 第一链cDNA 合成
• 5.2.6 实时荧光定量PCR
• 5.3 试验结果
• 5.3.1 乳腺上皮细胞油红O 染色
• 5.3.2 总RNA 提取结果
• 5.3.3 TIP47 的RT-qPCR 检测
• 5.4 讨论
• 5.4.1 关于实验方法及条件的优化
• 5.4.2 关于TIP47 基因的调控
• 5.5 小结
• 第六章 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介