克氏原螯虾溶血素的初步研究

论文摘要

溶血素是无脊椎动物体液免疫系统中的一个重要组成因子,本文以克氏原螯虾（Procambarus clarkii）为实验材料,对克氏原螯虾溶血活性及其影响因素、溶血过程的扫描电镜观察以及溶血素的分离纯化方法进行了研究。采用鸡血细胞悬液指示的溶血反应来测定克氏原螯虾血淋巴中的溶血活性,研究了不同温度、pH值、不同种类和浓度下的二价金属离子的溶血活性。证实了克氏原螯虾血淋巴中溶血活性的存在。在20～40℃,溶血活性随处理温度的升高而有所增强,当处理温度40℃时溶血活性达到最高；处理温度高于50℃时,溶血活性明显下降。当pH值在6～11时,溶血活性较高。实验证实添加Ca2+可以促进溶血活性增加,在5-15mmol/L浓度范围内,随着Ca2+度增加而增强。Ba2+浓度为5、10mmol/L时抑制溶血活性,浓度为15 mmol/L时溶血活性略高于浓度为0时。Mg2+对溶血活性有明显的抑制作用,溶血活性随Mg2+浓度从5-15 mmol/L的增加而逐渐降低。利用将溶破的血细胞团离心沉淀,进行系列固定、脱水、干燥,并进一步改进扫描电镜的样品制备方法。扫描电镜观察,可以直接观察到溶血作用中鸡血细胞膜上出现明显的六角性孔洞,直径约为1.5μm。提供了溶血过程发生的扫描电镜的证据。得到了溶血发生瞬间细胞膜上形态、结构发生的变化过程,为细胞膜溶破的机制提供了直接的资料。扫描电镜观察,一方面因为采用近似普通溶血反应发生的条件制备电镜样品,电镜照片表面的干净,一定程度上能够反映了溶血活性反应的精确性,另一方面,随着处理时间延长,溶血程度增加,从而证实了利用鸡血细胞的溶破作为测定溶血活性方法的合理性。尝试采用了一种自制的游离血细胞样品的离心沉淀吸附方法来进行电镜样品制备,提供了溶血这一类现象观察的扫描电镜制样方法新探索。对溶血素的分离纯化进行了尝试。首先采用硫酸铵盐析沉淀法进行粗提、透析,确定饱和度在45%—55%范围内具有较大溶血活性和最好的回收率。收集此饱和度的蛋白。然后利用Sephadex G-100进行凝胶过滤层析分离,此过程中改变各种条件后仍然洗脱出单峰,没有实现对样品蛋白的进一步分离。改用阴离子层析DEAE-Cellulose-32,各种条件后也仍然出现单峰。也尝试了血细胞凝胶板对电泳胶显色,蛋白条带切割并大量富集的分离纯化方法。以上这些分离工作为克氏原螯虾的溶血素进一步分离纯化提供了数据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 第一节 甲壳动物的免疫系统
• 1 细胞防御免疫
• 1.1 细胞分类
• 1.2 吞噬作用
• 1.3 包囊作用
• 1.4 结节形成
• 2 体液免疫因子
• 2.1 模式识别蛋白（PRPs）
• 2.2 酚氧化酶原激活系统
• 2.3 抗菌肽
• 2.4 凝集素
• 3 免疫系统的整合与溶血作用的地位
• 第二节 无脊椎动物的溶血素的研究进展
• 1 离子、温度与溶血作用
• 2 溶血作用合成分泌部位与作用机理研究
• 3 溶血作用的作用位点与抑制因子
• 4 溶血素的生化性质
• 5 溶血作用在免疫中的作用
• 第三节 研究目的和意义
• 第2章 克氏原螯虾溶血素溶血活性及其影响因子
• 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 抗凝剂
• 1.1.2 Alsever’s液
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 克氏原螯虾血清的制备
• 1.2.2 鸡红细胞悬液的制备
• 1.2.3 克氏原螯虾溶血活性的测定方法
• 1.2.4 温度对溶血活性的影响
• 1.2.5 pH值对溶血活性的影响
• 1.2.6 二价金属离子对溶血活性的影响
• 2 结果
• 2.1 温度对克氏原螯虾溶血活性的影响
• 2.2 pH值对克氏原螯虾溶血活性的影响
• 2.3 二价金属离子对克氏原螯虾溶血活性的影响
• 3 讨论
• 第3章 克氏原鳌虾血清对鸡血细胞溶血过程电镜观察
• 引言
• 1 材料和方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 实验用虾
• 1.1.2 实验用血
• 1.1.3 Alsever's液
• 1.1.4 抗凝剂
• 1.1.5 扫描电镜实验所需试剂
• 1.2 实验仪器
• 1.3 血细胞离心收集制备的扫描电镜观察的实验方法
• 1.3.1 血清的制备
• 1.3.2 溶血素对血细胞损伤的电镜观察
• 1.3.2.1 血细胞悬液的制备
• 1.3.2.2 离心收集
• 1.4 游离细胞样品的制备和观察实验方法
• 1.4.1 血清的制备
• 1.4.2 溶血素对血细胞损伤的电镜观察
• 1.4.2.1 细胞悬液的制备
• 1.4.2.2 扫描电镜样品制备
• 2 结果与讨论
• 2.1 血细胞离心收集制备的电镜观察的结果与分析
• 2.2 游离细胞样品的制备和观察的结果与分析
• 3 讨论
• 第4章 克氏原鳌虾溶血素的分离纯化
• 引言
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 Sephadex G-100样品缓冲液
• 1.1.2 Sephadex G-100洗脱液
• 1.1.3 DEAE-Cellulose-32样品缓冲液
• 1.1.4 DEAE-Cellulose-32洗脱液
• 1.1.5 其他药品
• 1.2 仪器
• 2 方法
• 2.1 活性检测
• 2.2 溶血素的浓缩
• 2.3 Sephadex G-100分子筛层析
• 2.3.1 样品准备
• 2.3.2 Sephadex G-100层析柱准备
• 2.3.3 上样与洗脱
• 2.3.4 样品收集
• 2.4 DEAE-Cellulose-32层析洗脱
• 2.4.1 样品准备
• 2.4.2 DEAE-Cellulose-32层析柱准备
• 2.4.3 上样与洗脱
• 2.4.4 样品收集
• 2.5 SDS-PAGE电泳纯度分析
• 2.5.1 制胶
• 2.5.2 电泳分析
• 2.5.3 染色
• 2.6 血细胞琼脂糖胶的制备
• 3 结果与分析
• 3.1 层析结果与分析
• 3.1.1 最佳硫酸铵饱和度的确定
• 3.1.2 克氏原螯虾溶血素的Sephadex G-100和DEAE-Cellulose-32层析
• 3.1.3 层析结果电泳检测
• 3.2 电泳条带富集的方法的结果与分析
• 4 讨论
• 4.1 层析结果讨论
• 4.2 电泳条带富集的方法结果讨论
• 结语
• 参考文献
• 致谢
• 附录