论文摘要
背景近年来,全世界变态反应性疾病的发病率明显上升。在所有的变态反应性疾病中,皮肤变态反应性疾病的发病率最高。因此,对于变态反应性皮肤病的研究,探讨如何有效地预防及治疗,是目前研究的热点之一。中医学对该类疾病进行了深入的研究,通过辨证施治,取得了良好的疗效。实验证明,针刺治疗Ⅳ型变态反应均能从多层次多途径来抑制机体变态反应的产生,并且具有传统西药所不具备的作用优势。因此,运用现代科学技术方法研究针刺治疗Ⅳ型变态反应的作用机理,将会为临床防治该类疾病提供新的思路。目的研究针刺对Ⅳ型变态反应模型豚鼠干预作用,评价其治疗Ⅳ型变态反应的疗效并探讨其作用机理。方法1.Ⅳ型变态反应模型豚鼠的建立及针刺对Ⅳ变态反应模型豚鼠炎症反应的影响。豚鼠购回后适应性喂养一周,自由摄食（饲料由本校动物实验中心提供）和摄水,室温18-22℃,相对湿度65%。造模过程是酒精消毒后于豚鼠颈背部剪去面积2×2cm大小的毛。用棉签沾5%2,4-二硝基氯苯（DNCB）丙酮溶液50 u1涂于背上致敏。于2周后,以0.1%2,4-二硝基氯苯DNCB 100 u1用于豚鼠左耳部致敏,1周1次,持续4周。第4次激发后72h,即三天后将豚鼠随机分组处理。按随机数字表,将36只豚鼠分三个组,每组12只。空白组、模型组、针刺组。空白组不给予任何处理;模型组除给予造模外不给于任何处理。针刺组在造模后选取穴位,根据《实验针灸学》取曲池（双）,血海（双）,并参照人体有关穴位,以动物比较学方法定位。用1寸毫针刺入所选穴位,将针柄分别连接至6805-2型电针治疗仪的电极上,疏密波进行治疗,5～10次/秒,以豚鼠安静耐受为宜。每日针刺1次,每次时间20min,治疗5天后间隔1天,继续治疗5天,共治疗10次为1疗程。取材时处死豚鼠,用打孔器（6mm）在小鼠左右双耳相同部位打孔,并分别称两侧耳片的重量,以两耳片重量之差为肿胀度,观察针刺治疗后豚鼠炎症反应的强弱。2.针刺对模型豚鼠耳切片的病理影响及真皮内炎性浸润细胞的变化,探讨针刺治疗Ⅳ型变态反应豚鼠模型的造模部位的病理变化及炎性浸润细胞的影响。经过造模处理后48h,用直径0.6mm的金属打孔器在模型组与针刺组左、右耳中部打孔,取相同大的组织块,先进行实验一中的步骤,然后采用10%福尔马林固定右耳组织块,和HE常规染色,在光镜下用网形目镜测微尺计数每mm单一核细胞、多形核白细胞数及淋巴细胞数,同时光学显微镜下观察各组病理变化。3.针刺对Ⅳ型变态反应模型豚鼠细胞因子Th1/Th2的影响。对模型组及针刺组进行造模,实验中处理的豚鼠采用于末次治疗后2h,心脏取血法取血,用移液管注入PE管中,2000r/min离心20min,取上清液,运用采用双抗体夹心ELISA法测定血清中TNF-α,IFN-γ、及IL-2、IL-4,IL-10为代表的Th1/Th2型细胞因子的含量。详细操作按试剂盒说明书进行。4.针刺治疗对Ⅳ型变态反应豚鼠模型神经肽类物质CGRP浓度的影响。对模型组及针刺组进行造模,实验中处理的豚鼠采用末次治疗后2h,心脏取血法取血,用移液管注入10%EDTA和抑肽酶的试管中,混匀,40℃,2000r/min离心20min,取lml血浆,分离血浆置于-25℃低温冰箱中待检,用放免法测定CGRP的浓度。结果1.三组豚鼠耳厚度及重量差是从宏观上说明其炎症反应的程度,左耳诱发前、后的厚度差、诱发左、右耳的厚度差及诱发后左、右耳组织块的重量差与空白组比较,P＜0.05,有显著性差异。所以说明针刺对炎症反应的抑制强度,表现为差越小,抗炎作用越强。2.在病理改变中显示空白组中皮肤表皮、真皮、软骨均未见明显病变,造模组皮肤表皮增生,棘层明显增厚,角化过度及角化不全,表皮内有轻度细胞间水肿,表皮突显著延长,真皮上部中度血管周围炎症浸润,以淋巴细胞居多,间有嗜中性粒细胞及纤维细胞,呈慢性湿疹病理改变,针刺组皮肤表皮轻度增生,棘层轻度增厚,与造模组比较程度减轻,真皮上部中度血管周围炎症浸润,其中散在淋巴细胞,单核细胞、嗜中性粒细胞及纤维细胞浸润,与造模组比较数量明显减少。这样从病理学角度说明针刺治疗Ⅳ变态反应的实验效果。3.针刺治疗前后Ⅳ型变态反应模型豚鼠Th1/Th2细胞因子水平变化。空白组、针刺组IL-2水平均较高,与模型组比较,差异均有显著性意义（P＜0.05）。TNF-α水平空白组较低,与模型组比较,差异有显著性意义（P＜0.05）。针刺组也较高,但与模型组比较,差异显著性意义（P＞0.05）。空白组、针刺组IFN-γ、IL-10的水平均较低,与模型组比较,差异均有显著性意义（P＜0.05）。空白组、针刺组IFN-γ/IL-10的值均较高,与模型组比较,差异均有显著性意义（P＜0.05）。IL-10的水平空白组最低,与针刺组比较,差异有显著性意义（P＜0.05）。Th1/Th2细胞因子IL-2、IFN-γ、IL-10和TNF-α之间的平衡紊乱得到明显改善,同时明显降低IFN-γ/IL-10的比值。这说明针刺对Ⅳ型变态反应豚鼠模型有显著的抗Ⅳ型变态反应的作用。同时通过相关分析发现TNF-α与豚鼠的局部耳片肿胀度呈正相关,这与既往对变应性皮炎局部细胞因子分泌的研究相符合。而针刺对慢性湿疹的豚鼠血清中的TNF-α有着明显的下调作用,其趋势较为显著。说明对炎症前因子TNF的下调作用是其抗变态反应的重要环节。同时经研究发现TNF-α与豚鼠的IFN-γ及IL-10亦呈正相关,说明在其发病机制中,TNF-α除了促进朗格汉斯细胞的迁移活化以及抗原提呈之外,对T淋巴细胞所分泌的各类效应细胞因子亦起着一定诱导作用,这也从另一方面佐证了TNF-α在慢性湿疹发病机制中所扮演的重要角色。4.对针刺治疗前后Ⅳ型变态反应模型豚鼠神经肽类物质血浆CGRP浓度的变化,结果空白组、模型组、针刺组两两比较,差异均有显著性差异（P＜0.05）,提示模型组的降钙素基因相关肽（CGRP）浓度显著低于造模前,在经过针刺治疗后浓度显著升高。符合针刺对机体神经肽的体液免疫的调节是通过对豚鼠血浆CGRP的上调作用而完成。结论:针刺对Ⅳ型变态反应模型豚鼠有显著的抗Ⅳ型变态反应的作用。
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